Name: Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Leer fibrinolyse volgen met de Chandler loop en RT-FluFF voor trombolyseonderzoek. Deze methode verbetert de fysiologische relevantie van in-vitro stolseloplossing onder stromingsomstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Heart, Lung, And Blood Institute van de National Institutes of Health onder Award Number R01HL167877. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Alle hieronder genoemde methoden zijn in overeenstemming met de protocollen van de Institutional Review Board (IRB) en de institutionele ethische commissie voor menselijk onderzoek. Alle gezonde vrijwilligers gaven schriftelijke en geïnformeerde toestemming voorafgaand aan bloeddonatie. Merk op dat alle materialen waarnaar in het protocol wordt verwezen, te vinden zijn in de materiaaltabel. Hoewel menselijke WB en plasma in dit protocol worden besproken, kan het gebruik van dierlijk bloed voor onderzoek en factorarme bloedproducten worden gekocht en vervangen.
1. Volbloed afname
<ol><li>Verzamel veneus volbloed (WB) van instemmende gezonde vrijwilligers met behulp van standaard aderlatingstechnieken. LET OP: Zorg ervoor dat universele voorzorgsmaatregelen worden gevolgd om het risico op contact met bloed of ander mogelijk besmettelijk materiaal in dit protocol te verminderen. Het gebruik van handschoenen, een laboratoriumjas en een gelaatsscherm is noodzakelijk.</li>
	<li>Verzamel ~50 ml WB rechtstreeks in 3,2% natriumcitraatbuisjes en doe het onmiddellijk in 50 ml-buisjes voor later gebruik. OPMERKING: Het is noodzakelijk om de buis vóór de bloedafname in de citraatbuis weg te gooien en ervoor te zorgen dat de buisjes zijn gevuld tot het door de fabrikant aanbevolen volume. Vers verzamelde WB zal het beste de stollingsdynamiek van de gastheer samenvatten. Kortstondige opslag van WB bij kamertemperatuur (≤4 uur voor gebruik) is toegestaan. WB wordt niet 's nachts bewaard, omdat is aangetoond dat dit de stollingsdynamiek beïnvloedt bij onderzoek via trombo-elastografie15.</li>
</ol>2. Vorming van stolsels
<ol><li>Voeg aan 3 ml gecitreerd volbloed fluorescerend (fluoresceïneisothiocyanaat [FITC]) gelabeld fibrinogeen (FITC-Fg) toe tot een eindconcentratie van 60 μg/ml (verhouding van 1:50 fluorescerend gelabeld fibrinogeen tot niet-gemodificeerd fibrinogeen, uitgaande van een endogene plasmafibrinogeenconcentratie van 3 mg/ml). OPMERKING: Deze verhouding kan worden verhoogd tot 1:10 met minimale impact op de morfologie van stolsels. 13,14 Fluorescerend gelabeld fibrinogeen kan worden gekocht of gegenereerd door fibrinogeen te laten reageren met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). Het mengen van fibrinogeen moet ≤5 minuten voor aanvang van de run worden gedaan.<ol><li>Als fibrinogeen eerder is gealiquoteerd en ingevroren, inspecteer dan de ontdooide FITC-Fg om er zeker van te zijn dat de polymerisatie niet voortijdig is begonnen, waardoor deze onbruikbaar wordt (zorg ervoor dat er geen deeltjes of vezels in de oplossing zitten).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de opstelling van de Chandler-lus voor met een trommel met een diameter van 120 mm in een waterbad van 37 °C (Figuur 1). Zorg ervoor dat het Chandler-lusapparaat in staat is om te draaien met een vaste rotatiesnelheid van 0-90 tpm tijdens het gehele stolselvormingsproces. OPMERKING: Aanvullende Chandler-lusinstellingen en -aanpassingen zijn te vinden in Zeng et al.16. okt.</li>
	<li>Snijd de slang (binnendiameter 5/32", buitendiameter 7/32") en vorm lussen die stevig maar niet strak om de trommel passen. Voor de aanbevolen slangmaat die hier wordt besproken, snijdt u een standaard PCR-slang van 200 μL voor gebruik als fitting om de uiteinden van de slang te verbinden om de gesloten lus te vormen. OPMERKING: Verschillende slangmaten kunnen worden gebruikt om stolsels van verschillende grootte te produceren16.</li>
	<li>Start de bloedstolling door 200 mM calciumchloride-oplossing toe te voegen in een verhouding van 1:17 calciumoplossing tot volbloed. Laad het bloed in de slang (vul ~50% van het volume van de buis) met behulp van een spuit van 3 ml. Plaats de lus onmiddellijk op de Chandler-lustrommel die de uiteinden verbindt en begin met draaien.<ol><li>Zorg voor een juiste menging met zachte inversie voordat u gaat laden om problemen te voorkomen die voortvloeien uit de bezinking van WB-componenten.</li>
		<li>Zorg ervoor dat elke run een gelijke hoeveelheid bloed aan elke buis wordt toegevoegd, omdat dit de grootte van het stolsel kan beïnvloeden als het niet consistent wordt gehouden.</li>
		<li>Aangezien luchtbellen in de bloedkolom ook van invloed kunnen zijn op de bloedstolling, verwijdert u ze door de buis voorzichtig op een "wip"-achtige manier te bewegen om het ontsnappen van luchtbellen te vergemakkelijken voordat u ze in de trommel laadt.</li>
	</ol></li>
	<li>Draai de trommel gedeeltelijk ondergedompeld in het waterbad met een rotatiesnelheid van 40 RPM om een berekende afschuifsnelheid van ~450 s-1 te bereiken. OPMERKING: Raadpleeg Zeng et al. voor informatie over berekende scharen op basis van slanggrootte en rotatiesnelheid (20 tot 60 RPM)16. Typische veneuze en arteriële afschuifsnelheden zijn respectievelijk 20-200 s-1 en 300-1.000 s-1, waarbij ~400-500 s-1 representatief is voor de longslagader.</li>
	<li>Laat stolsels zich 40-60 minuten vormen bij weinig licht om fotobleken van het fluorescerend gelabelde fibrinogeen te minimaliseren.</li>
	<li>Nadat de gewenste stollingstijd is bereikt, verwijdert u de stolsels uit de slang en gebruikt u ze onmiddellijk. Om ervoor te zorgen dat de stolsels voorzichtig worden verwijderd zonder de structuur in gevaar te brengen, keert u de slang voorzichtig om zodat het stolsel langzaam uit de buis in een kleine container kan glijden. OPMERKING: Het 's nachts bewaren van gevormde stolsels in gecittraat plasma of PBS bij 4 °C kan van invloed zijn op de daaropvolgende analyse van de stolselvertering in de stroomlus.</li>
</ol>3. Opstelling van het RT-FluFF-instrument
<ol><li>Zorg ervoor dat het stroomlusapparaat is aangesloten zoals te zien is in afbeelding 2 en dat alle verbindingen goed vastzitten. In het kort omvat het stroomlusapparaat, in de volgorde van de stroomrichting: pomp > demper > inlaatdruksensor > stollings- > uitlaatdruksensor > fluorometer > verwarmd reservoir > pomp. Pas de selectie van de pompcapaciteit, het experimentele debiet, de diameter en de lengte van de slang, de temperatuur, het reservoirvolume en de stolselgrootte/geometrie aan om te voldoen aan de experimentele behoeften die uniek zijn voor elk onderzoek. OPMERKING: Voor dit voorbeeld werden slangen met dezelfde diameter gebruikt in de Chandler-lus voor RT-FluFF. De slang kan voor meerdere runs op dezelfde dag worden gebruikt, maar moet worden gecontroleerd op degradatie of lekken en indien nodig worden vervangen/gespoeld. Spoelen wordt aanbevolen met warm gedestilleerd water tussen de runs door. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan het nodig zijn om de slang na elke run te vervangen.</li>
	<li>Zodra alle slangen zijn vastgezet, zet u de drukmonitor aan. Controleer of de drukmonitor 0 mmHg aangeeft voor zowel de inlaat- als de uitlaatsensoren. Als dit niet het geval is, opent u de kleppen om ervoor te zorgen dat de druksensoren open zijn voor atmosferische druk en zetten u de sensoren op nul.</li>
	<li>Zet het verwarmingsblok of het waterbad dat wordt gebruikt aan en houd de temperatuur in de loop van het experiment in de gaten. Houd de temperatuur dicht bij 37 °C om de fysiologische temperatuur van het menselijk lichaam na te bootsen.</li>
	<li>Zet de pomp aan tot het gewenste debiet om te controleren op lekken en controleer of de druksensoren werken. OPMERKING: Een debiet van ~160 ml/min in deze slangmaat vertegenwoordigt een afschuifsnelheid van ~500 s-1.</li>
	<li>Schakel de pomp uit om het laden van stolsels te vergemakkelijken.</li>
</ol>4. Het stolsel in de stroomlus laden
<ol><li>Als een eerder gemaakt stolsel dat is opgeslagen wordt gebruikt, zorg er dan voor dat u het stolsel op kamertemperatuur brengt voordat u het in het stroomlussysteem laadt.</li>
	<li>Massaverlies van stolsels is een belangrijke eindpuntmeting voor trombolysetests. Het is het beste om de massa van het stolsel te meten vlak voordat het in de stroomlus wordt geladen in plaats van te vertrouwen op eerdere metingen.<ol><li>Metingen van de massa van stolsels moeten altijd op dezelfde manier worden uitgevoerd om consistentie tussen monsters en over testdagen te garanderen, aangezien de vloeistofinhoud in en op de stolsels hun massa aanzienlijk kan beïnvloeden. De beste praktijk is om stolsels op laboratoriumdoekjes voorzichtig te deppen totdat er geen significante hoeveelheid vloeistof meer op het doekje afgeeft, en zorg ervoor dat u het stolsel niet samendrukt tijdens het meetproces.</li>
	</ol></li>
	<li>Dompel het stolsel onder in het plasma (autoloog of type-matched) of een andere mobiele fase-oplossing die in de stroomlus wordt gebruikt (zoals PBS of gedefinieerde media) in een ondiepe container zoals een weegschaal. De mobiele fase-oplossing moet rechtstreeks uit het systeemreservoir van 50 ml worden genomen om het totale systeemvolume te controleren. Er mag geen trombolytisch of farmaceutisch testmiddel aanwezig zijn tijdens de fase van het laden van stolsels. Het totale volume van de mobiele fase voor het uitvoeren van de stroomlus wordt aanbevolen om ≥50 ml te zijn en moet consistent zijn voor alle monsters.</li>
	<li>Verwijder het centrale deel van de stroomlusslang (tussen inlaat- en uitlaatsensoren) en bevestig een spuit van 10 ml aan het ene uiteinde van de slang.</li>
	<li>Gebruik het vrije uiteinde van de slang, plaats deze in het plasma (of mobiele fase) en neem een klein volume van de oplossing op om de slang te vullen. Plaats vervolgens de inlaat van de slang in de buurt van het stolsel en onderzoek het stolsel zorgvuldig om de kop (meestal het iets dikkere uiteinde van het stolsel) en de staart (uiteinde tegenover de kop) te identificeren. De kop van het stolsel moet in de richting van de inlaatdruksensor worden geplaatst en weg van de uitlaat. Plaats de slang aan het "staart"-uiteinde van het stolsel en zuig deze met de spuit in de slang. OPMERKING: in gevallen waarin de richting van de stolselkop/staart niet visueel kan worden bepaald, kan de richting het beste worden toegewezen op basis van het kennen van de draairichting van de Chandler-lus - de stollingskop wijst in de tegenovergestelde richting van de rotatie van de trommel.</li>
	<li>Bevestig de slang terug aan het hoofdapparaat, zodat het stolsel zich het dichtst bij de uitlaatdruksensor bevindt (de kop van het stolsel moet van de uitlaatsensor af wijzen). Zet het stolsel op zijn plaats vast door de slang en de stolselkop te doorboren met twee naalden van 30 G in een "X"-patroon. Laat deze naalden zitten voor de duur van de run. NOTITIE: Afhankelijk van de instellingen van de demper en de pomp kunnen extra naalden nodig zijn om ervoor te zorgen dat het stolsel niet voortijdig fragmenteert. Indien nodig kan een zeef worden toegevoegd aan de slang stroomafwaarts van het stolsel om te voorkomen dat stolselfragmenten in het systeem circuleren. Zodra een bepaald aantal naalden is vastgesteld om het stolsel vast te houden, houdt u dit consistent onder alle omstandigheden.</li>
	<li>Neem de rest van de mobiele fase-oplossing en doe deze in een buis van 50 ml als reservoir.</li>
	<li>Plaats het reservoir in het waterbad en plaats het in de inlaat- en uitlaatslang (de uitlaat is van de fluorometer en de inlaat gaat in de pompkop).</li>
	<li>Controleer of de gebruikte fluorometer is aangesloten en bewaakt. Controleer aan het begin van het experiment of de beginwaarde geschikt is in vergelijking met de basislijn van een mobiel fasesysteem. OPMERKING: Als er geen in-line fluorometer beschikbaar is, kan seriële periodieke bemonstering van het reservoir worden uitgevoerd met gedefinieerde tussenpozen gedurende de analyseperiode van de stroomlus. Verzamelde fracties kunnen onmiddellijk na voltooiing van het experiment worden afgelezen met behulp van een plaat met 96 putjes op een in de handel verkrijgbare spectrofotometer.</li>
	<li>Voeg 500 μL 100.000 ng/ml tPA rechtstreeks toe aan het reservoirvolume om een uiteindelijke tPA-concentratie van 1.000 ng/ml in 50 ml te bereiken. Het volume, de concentratie en het specifieke medicijn dat wordt toegevoegd, zijn afhankelijk van de gewenste doelcirculatieconcentratie en het volume van het systeemreservoir.</li>
	<li>Controleer het volgende voordat u de pomp start:<ol><li>Alle knooppunten zijn beveiligd.</li>
		<li>De twee kleppen boven de druksensoren bevinden zich in de daarvoor bestemde gesloten positie.</li>
		<li>Eventueel achtergebleven plasma (of vloeistof) is in het reservoir vervangen.</li>
		<li>Het trombolyticum is aan het reservoir toegevoegd en goed gemengd.</li>
		<li>De inlaatslang bevindt zich in de buurt van de bodem van het reservoir (dit zorgt voor minimale luchtbellen).</li>
		<li>De uitlaatslang is veilig en op de juiste hoogte voor de gewenste druk (afhankelijk van de locatie van het vat die wordt gemodelleerd).</li>
		<li>De draairichting van de pomp is correct (Stroomvolgorde: Pomp > Demper > Stolsel > Fluorometer > Reservoir > Pomp).</li>
		<li>Als het toerental van de pomp erg hoog is ingesteld (>150 tpm), begin dan met een lagere snelheid en voer het op om ervoor te zorgen dat de snelle drukverandering het stolsel niet fragmenteert of lekkage van de slang veroorzaakt.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het systeem de gegevens van de fluorometer op de juiste manier registreert en/of dat de benodigdheden zijn voorbereid voor periodieke bemonstering van de mobiele fase voor het aflezen van het tijdstip na het experiment.</li>
	</ol></li>
	<li>Zet de pomp aan en stel deze in om het gewenste volumedebiet van 160 ml/min te bereiken of verhoog het debiet totdat de gewenste druk is bereikt. Het systeem vult zich met vloeistof en bubbels. De bubbels zullen de fluorometrische waarden kunstmatig verhogen, dus kijk of de bubbels zijn verdwenen. Zodra ze dat doen, doet u de lichten uit en begint u met het verzamelen van gegevens.</li>
	<li>Laat de pomp draaien totdat het stolsel aanzienlijk is afgebroken of de gewenste experimentele tijd is verstreken (≥60 min). Voeg indien nodig reagentia toe aan het systeem tijdens het experiment via het reservoir om unieke experimentele omstandigheden te creëren voor het testen van een verscheidenheid aan trombolytische variaties. OPMERKING: De experimentele tijd is afhankelijk van het pompdebiet (afschuifniveau) en de concentratie van het trombolyticum.</li>
	<li>Zodra de test is voltooid, verlaagt u het volumetrisch debiet en verwijdert u de inlaatslang terwijl de pomp nog draait om het grootste deel van de vloeistof in het systeem in het reservoir te duwen (er zal een mobiele fase in de slang achterblijven). Koppel het stollingshoudende slanggedeelte aan de uitlaatdruksensorzijde van de slang los en laat deze in een weegboot zakken.</li>
	<li>Verwijder de naalden die het stolsel op zijn plaats houden om de resterende vloeistof uit het systeem te verzamelen en fragmenten te stollen/stolsels. Gebruik indien nodig een spuit om het systeem te reinigen.</li>
	<li>Weeg en verwerk het resterende stolsel voor aanvullende analyse, zoals de berekening van het percentage verloren massa of voor histologie.</li>
</ol>5. Reiniging van het systeem
<ol><li>Spoel tussen de monsters door het hele systeem met warm water op een hoog toerental (>150 tpm). Laad het water in het reservoir en laat het minstens 2 minuten door het systeem lopen, leeg het en laat het opnieuw draaien voor twee volledige systeemspoelingen. Als de fluorometerwaarde na deze spoelingen niet terugkeert naar de basislijn, herhaal dan het spoelproces voor een extra cyclus. Als het nog steeds niet is teruggekeerd naar de basislijn, vervang dan de slang volledig voordat u het volgende monster analyseert. OPMERKING: Tijdens de experimenten kunnen slangen worden hergebruikt tussen monsters; Vanwege de perforatie met naalden die worden gebruikt om het stolsel op zijn plaats te houden, moet het slanggedeelte tussen de inlaat- en uitlaatdruksensoren echter na elke run worden vervangen. Onder sommige experimentele omstandigheden kan het nodig zijn om de hele slangenset na elke run of clustering-assays te vervangen om kruisbesmetting van het monster te elimineren.</li>
	<li>Nadat alle monsters zijn uitgevoerd voor het experiment van die dag, verwijdert u alle slangen en gooit u deze weg. Schrob de T-splitsingen met heet water en een borstel tot ze schoon zijn en laat ze drogen en spoel de spuitdempers af met heet water. Gebruik 70% EtOH om te helpen bij de steriliteit.</li>
</ol>

Combinatie van de Chandler Loop en RT-FluFF voor ex vivo stollingslysisbewaking

<ol><li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+of+thrombolytic+therapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).</li>
<li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+ischemic+stroke+models%3A+replicating+human+stroke+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li>
<li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684(2014).</li>
<li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14(2006).</li>
<li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li>
<li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li>
<li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).</li>
<li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+in+haemostasis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833(2020).</li>
<li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).</li>
<li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).</li>
<li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li>
<li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization%2C+fibrinogenolysis%2C+or+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Vorming en etikettering van stolsels Het is aangetoond dat de Chandler-lus een gemakkelijke en effectieve manier is om reproduceerbaar stolsels te genereren die in-vivo trombi16 nabootsen. Fijnafstemmingsparameters zoals slanggrootte, rotatiesnelheden, trommeldiameter en stollingstijd zorgen voor een snelle generatie van stolsels onder verschillende afschuifomstandigheden die architecturale kenmerken kunnen vastleggen die worden gewaardeerd in een reeks trombi die zowel arteriële als veneuze bronnen nabootsen. De extra flexibiliteit van de mogelijkheid om markers zoals FITC-Fg te introduceren, breidt de potentiële toepassingen van deze trombi uit, zoals we hebben aangetoond in het RT-FluFF-systeem. Hoe rudimentair de onderliggende principes van de Chandler-lus ook zijn, er blijft een steile initiële leercurve die verband houdt met consistente stolselvorming terwijl tegelijkertijd bloed en bloedproducten worden gehanteerd tijdens het stolselvormingsproces. Dit komt voort uit het feit dat de coagulatie van WB extreem gevoelig is voor behandeling in de momenten voor en na het begin van de stolling. Van bijzonder belang is de selectie van de slangen die worden gebruikt tijdens de stap van de stolselvorming in de Chandler-lus, aangezien interacties met het bloedoppervlak de progressie van de stolselvorming kunnen beïnvloeden. Slangen moeten van medische of chirurgische kwaliteit zijn (niet-pyrogeen en niet-hemolytisch) en een lage bioreactiviteit vertonen. Zoals besproken in onze resultaten, wordt variatie in gevormde stolsels verwacht in de eerste leerfasen van de techniek, terwijl men een optimale workflow ontwikkelt op basis van experimentele schaal en unieke testaanpassingen. Het uiteindelijke bereiken van reproduceerbaarheid is cruciaal gezien de impact van stolselarchitectuur op het gedrag van een stolsel tijdens het ondergaan van fibrinolyse. Ten slotte is variatie in coagulatie, zelfs onder gezonde vrijwilligers, ook te verwachten en moet er rekening mee worden gehouden tijdens het experimentele ontwerp.
RT-FluFF-test Fluorometrische/spectrofotometrische kwantificering van fibrinolyse met FITC-Fg als marker biedt tal van voordelen ten opzichte van klassieke technieken die voornamelijk gebaseerd waren op de beoordeling van de massa van eindpuntstolsels. De mogelijkheid om de fibrinolysedynamiek in realtime of bijna in realtime te monitoren in een omgeving die fysiologische stromingsparameters benadert, vertegenwoordigt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van traditionele fibrinolytische drugsscreeningstests. Deze test is opzettelijk ontworpen op de gepresenteerde schaal om meer te lijken op klinisch relevante stolselgroottes, stroomveld, volumetrisch debiet en stolselmassabelasting in plaats van een volledig geminiaturiseerde microfluïdische benadering te volgen. Het verkleinen van RT-FluFF-apparatuur zou betekenen dat slangen met een kleinere diameter en/of kortere afstanden van buizen zouden moeten worden gebruikt. Als gevolg hiervan zou het systeem beginnen af te wijken van de gewenste stromingspatronen en fysiologische relevantie. Net als bij de Chandler-lus maakt het RT-FluFF-systeem de regeling van parameters zoals de afschuifsnelheid mogelijk door de stromingsdruk onder constante stroom te moduleren en te regelen welke stromende media worden gebruikt. Bovendien is het RT-Fluff-systeem ook geschikt voor pulserende stroming en unieke stolselvergistingsgeometrieën, terwijl het toch periodieke bemonstering van de mobiele fase tijdens het verteringsproces mogelijk maakt, wat niet mogelijk is in een Chandler-lus vanwege de roterende gesloten vergistingsopstelling. De impact van deze parameters op stolsellysis is diepgaand onderzocht als onderdeel van Zeng et al.14.
Alles bij elkaar kunnen de Chandler-lusvormige stolsels en de RT-FluFF-testslang dezelfde diameter hebben of variëren bij zowel de stolselvorming als de stolselvertering om verschillende niveaus van occlusie te bereiken, waarbij ze zich modelleren door bijna volledige bloedvatocclusie om trombo-embolie na te bootsen. Alle hierin beschreven tests maakten gebruik van dezelfde slangdiameter in zowel de Chandler-lus als het RT-FluFF-systeem. Met een grotere slangdiameter in het RT-FluFF-systeem moet het volume van het mobiele fasereservoir mogelijk worden vergroot om het extra volume op te vangen dat nodig is om het systeem te vullen. Het vergroten van het reservoirvolume kan ook de benodigde hoeveelheid trombolyticum/geneesmiddel verhogen die aan het systeem moet worden toegevoegd en zou ook de plasma- of mobiele fasebehoeften verhogen. Hoewel het gebruik van autoloog plasma ideaal zou zijn, zou het vereisen dat er buitengewoon grote hoeveelheden bloed worden afgenomen van individuele donoren om tegemoet te komen aan de vorming van Chandler-lusstolsels en de mobiele fasevolumes van RT-FluFF in alle tests en replicaten die nodig zijn om een heel experiment te voltooien. Om deze reden werd vaak type-matched gepoold plasma gebruikt dat was verkregen van een bloeddonatiecentrum of gekocht van een commerciële verkoper. Hoewel de totale RT-FluFF-testslang tot op zekere hoogte kan worden ingekort, zijn er beperkingen zodat alle componenten voldoende ruimte hebben om in de lus te blijven om de spijsverteringsexperimenten uit te voeren. Van bijzonder belang is het lange deel van de slang dat stroomopwaarts van het stolsel zelf wordt gebruikt en dat een minimumlengte moet overschrijden, berekend op basis van de diameter en het debiet van de slang, zodat laminaire stroming wordt bereikt door de tijd dat de stroom het zwevende stolsel bereikt. Ongeacht de keuze van de slangmaat, moeten dezelfde slangoverwegingen die zijn beschreven in de Chandler-lusstolselvormingsstap ook worden toegepast op de RT-FluFF-systeemslang. Het is belangrijk om te herhalen dat de slang tussen de druksensoren, waar het Chandler-lusvormige stolsel op zijn plaats wordt bevestigd via twee ingebrachte naalden in een "X"-patroon, na elke test moet worden vervangen om te voorkomen dat er lekken optreden op de naaldprikplaatsen. Het gebruik van naalden om het stolsel op zijn plaats te houden tijdens de spijsvertering onder stroming beperkt het ophopen van stolsels en biedt de mogelijkheid om het stolsel te oriënteren ten opzichte van de stroomrichting om de consistentie van test tot test te verbeteren. Hoewel hierin een enkel representatief onderzoek naar stolselvertering met behulp van tPA wordt beschreven, bieden de Chandler-lus en de RT-FluFF-test een hoge mate van aanpasbaarheid om een breed scala aan stolselstructuren, reportermoleculen, afschuifsnelheden en verteringsomstandigheden te accommoderen om nieuwe fibrinolytica te testen.
Beperkingen Zoals met alle huidige platforms of methoden die worden gebruikt om fibrinolytica te screenen, lijdt de RT-FluFF-test ook aan bepaalde zwakke punten die moeten worden erkend. Ten eerste worden stolsels die in de Chandler-lus worden gevormd, hoewel ze motieven vertonen die vaak aanwezig zijn in in-vivostolsels , nog steeds gevormd in een andere omgeving dan in-vivo-stolsels waar pulserende stroming en de interactie met endotheel bestaan17 Bovendien, hoewel FITC-Fg-concentraties werden geoptimaliseerd om de effecten op de stolselarchitectuur te minimaliseren, vertegenwoordigt de toevoeging van het gemodificeerde fibrinogeen nog steeds een afwijking van fysiologische omstandigheden. De keuze van plasma in de mobiele fase kan van invloed zijn op het gebruik van een fluorometer, aangezien er een kleine hoeveelheid achtergrondsignaal zal zijn die verband houdt met het eiwit- en lipidengehalte van het plasma dat van donor tot donor kan verschillen. Een potentieel significante beperking van de RT-FluFF-opstelling is de negatieve impact van RBC's op fluorometrische metingen, waardoor het gebruik van WB als mobiele fase wordt beperkt bij gebruik van FITC als een fluorescerende stolselverteringsmarker. Een haalbare methode om dit te verminderen, is door een centrifugatiestap te introduceren in pellet-RBC's voordat discrete tijdstippen op een spectrofotometer worden afgelezen, of door een andere clotvergistingsreporter-tag te gebruiken die minder wordt beïnvloed door de aanwezigheid van RBC's18. Er moet een zorgvuldige afweging worden gemaakt op basis van het ontwerp van de test om ervoor te zorgen dat belangrijke variabelen worden gecontroleerd. Als plasma bijvoorbeeld de mobiele fase bij uitstek is, is het het beste om plasma over veel donoren te bundelen om de stolling en fibrinolysevariabiliteit te minimaliseren. Ten slotte, zoals bij elk fluorescerend gelabeld eiwit, ontstaat het probleem van afschrikken natuurlijk omdat de FITC-tag relatief dicht bij elkaar aanwezig is op het oppervlak van het fibrinogeen19.
Conclusies en toekomstige richtingen Het bestuderen van een dynamisch proces zoals trombolyse vereist een even dynamische omgeving waarin fysiologische omstandigheden kunnen worden gerepliceerd en meerdere parameters tegelijkertijd kunnen worden gecontroleerd. Het high-fidelity RT-FluFF-systeem vult deze leemte op en zal dienen als een belangrijk hulpmiddel bij de toekomstige ontwikkeling en screening van nieuwe trombolytica voordat ze worden vertaald naar diermodellen. RT-FluFF is een zeer veelzijdig platform, met meerdere mogelijkheden die hierin niet zijn besproken, maar die zeker in protocollen kunnen worden opgenomen, afhankelijk van de unieke behoeften van het ontwerp van farmaceutische geneesmiddelen, het werkingsmechanisme of de replicatie van verschillende stollingsziektetoestanden. De voordelen die we hebben kunnen waarderen binnen het RT-FluFF-systeem zijn de volgende: (a) variabele slanggeometrieën en -configuraties, (b) drukbewaking in real-time correleren met de mate van lumenocclusie, (c) fluorescentiemetingen in real-time waarvoor geen tussenkomst van de gebruiker nodig is, (d) testduur en flexibiliteit van de monsterfrequentie, (e) gebruik van een reservoir om in-vivo-omstandigheden na te bootsen, (f) in-vivo-achtige afschuifstroompatronen, (g) optie om pulsatiele stroming op te nemen, (h) aanzienlijke flexibiliteit in de vorming van Chandler-lus van verschillende ziekterepresentatieve stolselanalogen, (i) de mogelijkheid om de effecten van geneesmiddelen op stolselvorming of stolselvertering te testen, en (j) directe beeldvorming van stolselsubstraat om de vertering van bulkstolsels door de doorzichtige slang te volgen, maakt bovendien navertering mogelijk, longitudinale video-analyse.

Ziekten die fundamenteel voortkomen uit trombo-embolische etiologieën vormen een belangrijke bron van morbiditeit en mortaliteit in de huidige samenleving. Manifestaties van trombo-embolische pathogenese omvatten, maar zijn niet beperkt tot, myocardinfarcten, ischemische beroertes, diepe veneuze trombose en longembolieën1. Er is enorm veel lopend onderzoek, verspreid over meerdere disciplines, dat draait om de ontwikkeling van veilige en effectieve methoden om met pathogene trombose om te gaan. Variaties in arteriële en veneuze manifestaties van trombose en variërende anatomische locaties hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende behandelingsbenaderingen. Acute behandeling is echter over het algemeen gebaseerd op het gebruik van farmacologische trombolyse via plasminogeenactivatoren met de mogelijkheid van mechanische trombectomie onder bepaalde klinische omstandigheden2.
De ontwikkeling van nieuwe farmacologische behandelingsstrategieën is fundamenteel gebaseerd op zowel in-vivo diermodellen als in-vitro vergistingsmodellen voor preklinische tests 3,4. In-vivo-modellen profiteren van nature van hun vermogen om de complexe interactie van verschillende fysiologische parameters op de werkzaamheid van de behandeling vast te leggen, waaronder de klaring van farmaceutische middelen en cellulaire interacties met geneesmiddelen. Deze zelfde complexiteit maakt dergelijke modellen echter vaak behoorlijk kostbaar en introduceert extra problemen bij het isoleren van de onderliggende farmacodynamiek/kinetiek bij dieren die aanzienlijk verschillen van de menselijke fysiologie. De ontwikkeling van in-vitromodellen heeft geholpen door een gedistilleerde testomgeving te vergemakkelijken waarin geneesmiddelenontwikkeling en screening kunnen worden uitgevoerd, maar vaak niet de getrouwheid hebben die nodig is om de bestudeerde ziektetoestand te recapituleren.
Vaak gevonden in-vitroprotocollen voor het testen van nieuwe trombolytica zijn gebaseerd op het gebruik van stolsels die onder statische omstandigheden worden gevormd en gelyseerd, waarbij de resterende stolselmassa als het primaire eindpunt dient 5,6. Helaas houden dergelijke technieken geen rekening met de mechanische aspecten van stolsellysis, zoals turbulente stroming en transtrombusdrukdalingen, die de farmacodynamiek van testgeneesmiddelen aanzienlijk kunnen veranderen. Bovendien bevatten stolsels die onder statische omstandigheden worden gevormd microarchitectuur die verschilt van fysiologische stolsels. Het is reproduceerbaar aangetoond dat de aanwezigheid van afschuiving tijdens de vorming van stolsels van invloed is op de resulterende stolselkenmerken zoals activering van bloedplaatjes en fibrine-crosslinking. Stolsels die onder afschuifstroom worden geproduceerd, vertonen een complexe heterogeniteit van punt tot staart die afwezig is in statisch gevormde stolsels 7,8. Dergelijke afwijkingen van de fysiologische stolselarchitectuur kunnen van invloed zijn op belangrijke karakterisering van de ontwikkeling van geneesmiddelen, waaronder de penetratie van geneesmiddelen in een trombus en de daaropvolgende lysisefficiëntie9.
Om enkele van deze beperkingen in verband met het gebruik van statische stollings-/stolsellysemodellen aan te pakken, heeft de toepassing van de Chandler-lus voor zowel stolselvorming als stolsellysis in aanwezigheid van afschuiving een heropleving gekend10. Hoewel dergelijke systemen een betere weergave van de stromingsdynamiek mogelijk maken en stolsels genereren met een meer fysiologisch relevante architectuur in vergelijking met relatief statische tests, vertegenwoordigen hun vereenvoudigde stroomomstandigheden nog steeds een afwijking van de fysiologische omstandigheden. Ten slotte zijn er ook microfluïdische benaderingen toegepast vanwege hun gemakkelijke beeldvorming en uniforme stroompatronen; Ze blijven echter een significante verwijdering van de fysiologische aandoeningen die worden verwacht in de grotere bloedvaten die voornamelijk worden aangetast bij de meeste klinisch relevante trombo-embolische aandoeningen11,12.
Met de bovenstaande discussie in het achterhoofd hebben we een high-fidelity, in-vitro trombolysemodel ontwikkeld voor preklinische screening van trombolytische geneesmiddelen. Het model is gericht op het aanpakken van enkele van de huidige valkuilen die hierboven zijn beschreven op het gebied van screening op nieuwe trombolytische therapie en werd gevalideerd voor reproduceerbaarheid en gevoeligheid bij verschillende concentraties van weefselplasminogeenactivator (tPA). Het hierin beschreven systeem biedt fysiologische afschuifstromen met behulp van een peristaltische pomp, een drukdemper, een verwarmd reservoir, twee druksensoren, een in-line fluorometer en een fluorescerend gelabeld Chandler-lus shear-formed stolselanaloog om real-time tracking van fibrinolyse13 te vergemakkelijken. Alles bij elkaar wordt het totale systeem de Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 genoemd en dit manuscript bespreekt de fijne kneepjes van het succesvol opzetten en uitvoeren van assays in dit high-fidelity in-vitro trombolysemodel.

<table><tbody><tr><td>30 G Disposable Hypodermic Needles</td><td>Exel International </td><td>26439</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td><td>Corning</td><td>3635</td><td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td></tr><tr><td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td><td>Air-Tite</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF Apparatus, dampeners</td></tr><tr><td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>DI water source</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5670</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>Disposable BP Transducers</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td>RT-FluFF Apparatus</td></tr><tr><td>Drager Siemans HemoMed Pod</td><td>Drager</td><td>5588822</td><td>RT-FluFF Apparatus</td></tr><tr><td>Drager Siemans Patient Monitor</td><td>Drager</td><td>SC 7000</td><td>RT-FluFF Apparatus</td></tr><tr><td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td><td></td><td></td><td>Chandler loop,</td></tr><tr><td>Face Shield</td><td>Moxe</td><td>SHIELDS10</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td><td>Masterflex</td><td>30600-04</td><td>RT-FluFF Apparatus</td></tr><tr><td>Fluorescein (FITC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>General-Purpose Water Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Hotplate 4 &times; 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>RT-FluFF Apparatus</td></tr><tr><td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td></tr><tr><td>Human Whole Blood&nbsp;</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-WB-SDS&nbsp;</td><td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td></tr><tr><td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td><td>Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td></tr><tr><td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td><td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td></tr><tr><td>Motor Speed Controller</td><td>CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>RT-FluFF Apparatus</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>06424-15&nbsp;</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td></tr><tr><td>Switching Power Supply</td><td>SoulBay</td><td>UC03U</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>Tissue plasminogen activator, human</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0831</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>Tubing ID 1/4'', OD 3/8''</td><td>Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td></tr><tr><td>Tubing ID 5/32", OD 7/32"</td><td>Tygon</td><td>ND-100-65, ADF 00009&nbsp;</td><td>Other Consumables</td></tr><tr><td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td><td>uvBeast</td><td>uvB-V3-365-MINI</td><td>Chandler loop, used to check completed clots</td></tr><tr><td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td><td>Pangyoo</td><td>ZGA37RG</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fibrinolyse volgen van chandler loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Trombo-embolie en gerelateerde complicaties zijn wereldwijd een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit en er zijn verschillende tests ontwikkeld om de efficiëntie van trombolytische geneesmiddelen zowel in vitro als in vivo te testen. Er is een toenemende vraag naar meer fysiologisch relevante in-vitro stolselmodellen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege de complexiteit en kosten die gepaard gaan met diermodellen, naast hun vaak gebrek aan vertaalbaarheid naar de menselijke fysiologie. Stroming, druk en afschuifsnelheid zijn belangrijke kenmerken van de bloedsomloop, waarbij stolsels die onder stroom worden gevormd andere morfologie- en spijsverteringskenmerken vertonen dan statisch gevormde stolsels. Deze factoren zijn vaak niet vertegenwoordigd in conventionele in-vitro stollingsverteringstests, wat farmacologische implicaties kan hebben die van invloed zijn op de slagingspercentages van geneesmiddeltranslationen.
De Real-T ime Fluorometrische Flowing F-ibrinolyse(RT-FluFF)-test is ontwikkeld als een high-fidelity trombolysetestplatform dat gebruik maakt van fluorescerend gelabelde stolsels die worden gevormd onder afschuifstroom, die vervolgens worden verteerd met behulp van circulerend plasma in de aan- of afwezigheid van fibrinolytische farmaceutische middelen. Door de stroomsnelheden van zowel de stolselvorming als de vergistingsstappen van stolsels aan te passen, kan het systeem arteriële, pulmonale en veneuze omstandigheden imiteren in zeer uiteenlopende experimentele opstellingen. Metingen kunnen continu worden uitgevoerd met behulp van een in-line fluorometer of door discrete tijdstippen te nemen, evenals een conventionele meting van de massa van stolsels op het eindpunt. De RT-FluFF-test is een flexibel systeem dat het mogelijk maakt om de vertering van stolsels in realtime te volgen onder stromingsomstandigheden die de in-vivo fysiologische omstandigheden nauwkeuriger weergeven, terwijl de controle en reproduceerbaarheid van een in-vitro-testsysteem behouden blijven.

Vorming van stolsels in de Chandler-lus Bij het vormen van stolsels streefden we over het algemeen naar viervoudige stolsels om ervoor te zorgen dat als er stolseluitschieters (op basis van grove morfologie en massa) bestonden, we nog steeds de mogelijkheid hadden om drievoudige trombolyse-assays uit te voeren. Uitgaande van optimale beladingsomstandigheden, zouden de stolsels allemaal vrij uniform moeten zijn in lengte (~3,3 cm), gewicht (~100 mg) en uiterlijk zoals weergegeven in figuur 3. Bij het gebruik van FITC-Fg wilden we ook stolsels onder UV-licht onderzoeken om een relatief uniforme dispersie van fluorescentie te garanderen, in tegenstelling tot onregelmatige gebieden met hyperfluorescerende etikettering in het stolsel. Het variëren van de mate van FITC-Fg in het volbloed zou het gewicht van stolsels of het uiterlijk binnen onze onderzochte concentraties niet moeten veranderen; de architectuur van microstolsels werd echter beïnvloed bij de hoogste FITC-Fg-concentraties (1:5 FITC-Fg tot niet-gemodificeerd Fg). Eerder werk van Zeng et al. legt het brede scala aan stolselfenotypes vast die in de Chandler-lus worden verwacht, afhankelijk van het gekozen afschuifniveau16.
Soms kan afwijkende stolling optreden. De meest voorkomende problemen met stolselvorming vallen in een van de twee categorieën: (i) voortijdige stolling en (ii) verminderde stolling. Bij voortijdige stolling zal het volledige bloedvolume stollen in de Chandler-lusslang. Dit wordt duidelijk wanneer de trommelrotatie wordt ingeschakeld, omdat het bloed niet "stroomt", maar aan de wanden van de slang blijft plakken en tegelijkertijd draait. In dergelijke omstandigheden zijn deze stolsels niet bruikbaar en moeten ze worden weggegooid. Om dit te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat zodra de stolling is geactiveerd met toevoeging van calciumchloride, de lus onmiddellijk wordt gesloten en op de roterende trommel wordt geplaatst om te stollen. De tweede omstandigheid, of verminderde stolling, doet zich voor wanneer monsters niet voldoende zijn gemengd of als het bloed begint te stollen voordat de rotatie is gestart, maar niet zo significant is als in omstandigheid (i). Stolsels met de bovenstaande problemen hebben de neiging om draderig en dun te lijken wanneer ze worden gehanteerd en hebben vaak aanzienlijk verhoogde stolselmassa's. Fenotypisch zullen ze stolsels benaderen die worden gezien bij een zeer lage veneuze schaar, omdat dit in wezen stolling vertegenwoordigt in de setting van stasis. Onregelmatige stolsels moeten af en toe worden verwacht en worden weggegooid.
RT-FluFF fluorometer kalibratie Een belangrijk kenmerk van het RT-FluFF-systeem is de fluorometer, of spectrofotometer, die wordt gebruikt om trombolyse te volgen gedurende de verstreken stollingsverteringsperiode. Voordat er experimenten worden uitgevoerd, is het van cruciaal belang om de goede werking van de fluorometer of spectrofotometer te garanderen. Aangezien we onze fluorometer speciaal voor het RT-FluFF-apparaat hebben ontworpen, moesten we ervoor zorgen dat deze goed correleerde met de spectrofotometer in aanwezigheid van bekende hoeveelheden FITC-Fg-verdunningen in een statische oplossing (Figuur 4A). Toen we eenmaal in staat waren om met vertrouwen het lineaire bereik van onze fluorometer te bepalen, wilden we vervolgens zien hoe de fluorometer zich zou gedragen in aanwezigheid van stroming. We hebben de functionaliteit geverifieerd door stapsgewijs fluoresceïne in de stromende oplossing te injecteren om een stapsgewijze toename van de fluorescentie te volgen om de reproduceerbaarheid van fluorometermetingen beter te begrijpen en te bepalen hoe snel fluorescentie in evenwicht is binnen het stromende systeem (Figuur 4B). Vervolgexperimenten werden uitgevoerd door zowel fluoresceïne als FITC-Fg gestaag op een continue manier in de oplossing te injecteren om de continue fluorescentieafgifte die van de fibrinolyse-experimenten werd verwacht, beter na te bootsen (Figuur 4C). De afgebeelde verschillen in helling tussen FITC-Fg en FITC worden verondersteld voort te komen uit de effecten van afschrikking die optreedt wanneer FITC in de nabijheid van zichzelf wordt geconjugeerd, zoals wanneer veel FITC-moleculen worden geconjugeerd tot een enkel eiwit (fibrinogeen in dit geval). Uiteraard zullen de stapsgewijze verhogingen en hellingen niet alleen verschillen op basis van de gebruikte concentraties FITC/FITC-Fg, maar ook op basis van het aantal FITC-moleculen per fibrinogeen. In het verlengde daarvan wordt het van cruciaal belang om de mate van FITC naar fibrinogeenconjugatie te controleren bij het uitvoeren van experimenten met behulp van de RT-FluFF als de hoop is om gegevens over talrijke stolselbatches te vergelijken. Door uitgebreide experimenten hebben we ontdekt dat ~14 FITC-conjugaties per fibrinogeen zorgen voor een goed fluorescerend signaal om de vertering van stolsels te volgen, terwijl ze stabiel blijven in oplossing (beperkte voortijdige aggregatie) en met minimale impact op de resulterende microstructuur van stolsels. Het is belangrijk op te merken dat telkens wanneer zuivere, niet-gestlotte, FITC-Fg door het RT-FluFF-apparaat wordt geleid, de blootstelling van FITC-Fg aan hoge afschuiving de aggregatie ervan kan bevorderen. Dit fenomeen wordt meestal waargenomen op de kruispunten van slangverbindingen en in de slangen van de pompkop en kan na verloop van tijd van invloed zijn op de beschikbare fluorescentie in de oplossing.
Bij het verzamelen van monsters uit de stroomlus op discrete tijdstippen om de fluorescentie op een spectrofotometer af te lezen, zijn veel van deze overwegingen in verband met de kalibratie van de fluorometer niet nodig. Het is echter nog steeds nodig om het dynamische bereik van de specifieke spectrofotometer die wordt gebruikt te onderzoeken om ervoor te zorgen dat FITC-Fg-labeling, de hoeveelheid FITC-Fg in het Chandler-lusgevormde stolsel en de grootte van het stolsel allemaal zijn geoptimaliseerd in uw systeem. Het wordt aanbevolen om monsters onmiddellijk na isolatie van het systeem te lezen of in een plaat met 96 putjes te plaatsen voor multiplex-lezingen na voltooiing van het experiment. Indien nodig kunnen de monsters direct na het verzamelen worden aangezuurd om verdere enzymatische activiteit te elimineren voordat ze worden geanalyseerd.
RT-FluFF lysis van stolsels Om het RT-FluFF-systeem te valideren met behulp van stolsels gevormd onder een arteriële schaar in de Chandler-lus, gebruikten we menselijk plasma als de mobiele fase in het apparaat met tPA (Alteplase) als fibrinolytisch middel. De onderzochte concentraties van tPA varieerden van 0 tot 1.000 ng/ml. Om de omstandigheden van de menselijke longstroom na te bootsen, werd de temperatuur van het plasmareservoir op 37 °C gehouden en fysiek verhoogd tot 8 cm boven het stolselniveau om een gemiddelde stroomdruk van 12 mmHg te geven, waarbij de pompsnelheid werd aangepast om een afschuifstroom van ~500 s-1 te genereren bij afwezigheid van stolsel. Pulserende stromingsdempers werden aan het systeem toegevoegd om te zorgen voor een minimale variatie tussen piek- en daldruk van de peristaltische pomp om een bijna constante afschuifsnelheid te bereiken (Figuur 4D). Bij afwezigheid van een drukdemper fluctueert de uitgangsdruk van de peristaltische pomp aanzienlijk vanwege de aard van de manier waarop deze stroming produceert door kleine pakketjes vloeistof door het systeem uit te werpen terwijl de pompkop draait. Stolsellysis werd waargenomen in de loop van 60 minuten. Zoals verwacht zorgden stijgende concentraties tPA voor verhoogde percentages stolsellysis (RFU/minuut) en verhoogd massaverlies in vergelijking met omstandigheden met minder of geen tPA. Bij een tPA-concentratie van 1.000 ng/ml werd ~85% stolsellysis bereikt gedurende een verteringsperiode van 60 minuten. Bij het onderzoeken van grove beelden van stolsels die lysis ondergaan, kan men begrijpen dat lysis voornamelijk zal optreden in de staartgebieden van het stolsel voordat het de meer dicht gestructureerde kop beïnvloedt, zoals blijkt uit zowel fysieke degradatie van de stolselarchitectuur als verlies van oppervlaktefluorescentie. Verwacht uitrekken van stolsels zal ook optreden op basis van verlies van mechanische integriteit in de loop van de tijd op een afschuifsnelheidsafhankelijke manier.
Hoewel significante verschillen in stollingslysesnelheden kunnen worden gewaardeerd, grofweg en op basis van fluorescentie-afgifte, is er geen perfect lineair verband tussen fluorescentie-afgifte en de hoeveelheid fibrinolyticum die aanwezig is. Dit is het best te zien in figuur 5. Fibrinolyse in op WB gebaseerde stolsels leidt natuurlijk tot het vrijkomen van niet alleen FITC-Fg-fragmenten, maar ook rode bloedcellen (RBC's) die tijdens de vorming van stolsels in de fibrinenetwerken worden opgesloten. Het vrijkomen van deze rode bloedcellen in het RT-FluFF-apparaat zal het circulerende plasma merkbaar rood beginnen te kleuren. Deze colorimetrische verandering in het circulerende plasma kan een negatieve invloed hebben op de fluorescerende emissie van circulerende FITC-Fg die wordt gelezen door de fluorometersensor. Naarmate de fibrinolytische concentraties de bovengrenzen bereiken, overheerst de mate van FITC-Fg-afgifte in oplossing de RBC-effecten op de fluorescentie-emissies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de opstelling van de Chandler Loop. Met bloed gevulde buisjes die op de Chandler-lustrommel zijn geladen, worden tijdens het stolselvormingsproces ondergedompeld in een waterbad van 37 °C met gedimde lichten. De trommel wordt met een constante rotatiesnelheid gedraaid via een gelijkstroommotor, aandrijfas en besturingskaart. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Zeng et al14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van het RT-FluFF systeem. Belangrijke componenten van het systeem worden op de afbeelding geïdentificeerd. In de afbeelding is een enkele demper met een groot volume afgebeeld om pulsaties in de stroom die gepaard gaat met het gebruik van een peristaltische pomp te minimaliseren. Bij afwezigheid van een in-line fluorometer zijn er twee extra opties voor periodieke bemonstering: 1) bemonstering rechtstreeks uit het reservoir; of 2) het opnemen van een in-line bemonsteringspoort om de mobiele fase uit te extraheren. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Zeng et al14. Afkorting: RT-FluFF = Real-time fluorometrische stromende fibrinolyse-assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig03.jpg"> Figuur 3: Bruto Chandler-lus FITC-Fg-gelabelde WB-stolselkenmerken, inclusief massa en fysieke verschijning onder omgevings- en UV-licht. (A) Consistente stolselvorming onder diverse stollingsomstandigheden is haalbaar door fijnafstemming van het Chandler-lusprotocol voor de vorming van stolsels. Het is belangrijk op te merken dat de massa's en het uiterlijk van stolsels aanzienlijk zullen variëren, afhankelijk van de diameter van de slang, de rotatiesnelheid en de lengte van de stolselvormingstijd. De afgebeelde stolsels werden gevormd bij 37 °C gedurende 1 uur met een afschuifsnelheid van 506 s-1. Schaalbalken = 20 mm. (B) Massa's stolsels gevormd in de Chandler-lus met behulp van de respectieve verhoudingen van FITC-Fg. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie voor meer dan of gelijk aan drievoudige gegevenspunten. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Zeng et al14. Afkortingen: FITC-Fg = fluoresceïne isothiocyanaat-gelabeld fibrinogeen; WB = volbloed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig04.jpg"> Figuur 4: Karakterisering van de fluorometer. (A) RT-FluFF in-line fluorometer vergelijking met een spectrofotometer in de context van bekende hoeveelheden FITC-Fg-verdunningen. (B) Stapsgewijze introductie van fluoresceïne in het RT-FluFF-systeem om de reproduceerbaarheid van de fluorometer en de fluorescentie-evenwichtstijd in stromend menselijk plasma te bepalen. (C) Continue infusies waarbij fluoresceïne en FITC-Fg worden vergeleken in het RT-FluFF-platform. De verschillen in helling komen waarschijnlijk voort uit fluorescentie-afschrikking in de FITC-Fg-groep. (D) Golfvormen van de uitlaatdruksensor (poststolsel) die verband houden met het gebruik van dempers van verschillende grootte onder dezelfde volumestroomomstandigheden. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Zeng et al14. Afkortingen: FITC-Fg = fluoresceïne isothiocyanaat-gelabeld fibrinogeen; RT-FluFF = Real-time fluorometrische stromende fibrinolyse-analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig05.jpg"> Figuur 5: Trombolyse in het RT-FluFF platform. (A) Representatieve hellingen van fluorescentie stijgen in de loop van 60 minuten van stolselvertering in aanwezigheid van circulerende tPA. Let op de aanvankelijke vertragingstijd van de trombolyse, aangezien tPA-activering van plasminogeen en stolselvertering niet onmiddellijk is. (B) Percentage stolselmassa verloren bij verschillende concentraties tPa en verschillende trombolysemodaliteiten, waaronder: het RT-FluFF-systeem, Chandler-lusstolselvergisting onder constante afschuiving en statische (geen afschuiving) stolselvergisting. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie voor meer dan of gelijk aan drievoudige gegevenspunten met dubbele sterretjes die een p-waarde < 0,01 aangeven en drievoudige sterretjes die een p-waarde < 0,001 aangeven. (C) Bruto kenmerken van trombolyse bij 200 ng/ml tPA. Dit cijfer is gewijzigd van Zeng et al.14. Afkortingen: RT-FluFF = Real-time fluorometric flowing fibrinolysis assay; tPA = weefselplasminogeenactivator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

In-vitro trombolyse-assays hebben vaak moeite om in-vivo-omstandigheden na te bootsen, of het nu gaat om de modeltrombus die wordt verteerd of in de omgeving waarin trombolyse plaatsvindt. Hierin onderzoeken we hoe de koppeling van de Chandler-lus en Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) wordt gebruikt voor high-fidelity, ex-vivo, stolsellysisbewaking.

Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Trombose wordt in verband gebracht met tal van medische aandoeningen en de huidige behandelingen riskeren ernstige bloedingen. De doorstroming van de bloedsomloop heeft een aanzienlijke invloed op de structuur van de bloedstolsels. Het opnemen van flow in in-vitromodellen kan hun fysiologische relevantie verbeteren, waardoor betere kandidaten voor in-vivo-tests kunnen worden geselecteerd.De tests voor de studie van fibrinolytica maken voornamelijk gebruik van statische stolsel- of microfluïdische systemen om eigenschappen zoals lysistijd, stolselstructuur of visco-elasticiteit te beoordelen. Statische stollingslysistesten zijn doorgaans gebaseerd op spectrofotometrische metingen of bepaling van de stolselmassa als eindpunten om de fibrinolyse-efficiëntie te evalueren. Bij de huidige trombolytische tests wordt gebruik gemaakt van statisch gevormde stolsels, die structureel verschillen van die welke onder stromingsomstandigheden worden gevormd.Microfluïdische systemen houden rekening met stromingsdynamiek, maar hun kleinere schalen creëren unieke hemodynamica en stolselstructuren. De momenteel ontwikkelde RT-FluFF-test biedt het gemak om fibrinolyse in realtime te bewaken onder fysiologische stromingsomstandigheden. Dit betekent dat we nu een platform hebben dat controle over meerdere parameters mogelijk maakt om omstandigheden na te bootsen die dichter bij in-vivo onderzoeksmodellen liggen voor een betere vertaling bij het screenen van nieuwe trombolytica.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het hierin beschreven model voor FeCl3 geïnduceerde trombose bij muizen wordt hier beschreven. Er wordt een methode gepresenteerd om trombusgroei te bewaken door middel van intravitale microscopieobservatie op een mesenterisch vat en door bloedstroommeting in de halsslagader.

Ferric-Chloride geïnduceerde trombose Muis Model op halsslagader en Mesenterium Vessel

Wij rapporteren een verfijnde procedure van de ijzerchloride (FeCl3) geïnduceerde trombose modellen op de halsslagader en mesenterica evenals ader, efficiënt gekarakteriseerd met behulp van intravitale microscopie tot tijd om trombi vorming occlusief bewaken.

IJzer-Chloride geïnduceerde Murine Trombose Models

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Fibrin is verantwoordelijk voor stolselvorming tijdens hemostase en trombose. Troebelheidstesten en tromboelastograhy (TEG) kunnen worden gebruikt als synergetische instrumenten die complementaire beoordeling van een stolsel bieden. Deze twee technieken samen kunnen meer inzicht geven in hoe stollingscondities de vorming van fibrinstolsel beïnvloeden.

Gebruikmaken van troebelheid en trombo-lastografie voor complementaire clot karakterisering

Hier gepresenteerd is een protocol voor een gestandaardiseerd in vitro hemodynamic loop model. Dit model maakt het mogelijk om de hemocompatibiliteit van perfusiebuizen of vasculaire stents te testen in overeenstemming met ISO (International Organization for Standardization) norm 10993-4.

Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

Traditionele modellen met fototrombotische beroerte (PTS) induceren voornamelijk dichte bloedplaatjesaggregaten met een hoge weerstand tegen weefselplasminogeenactivator (tPA)-lytische behandeling. Hier wordt een gemodificeerd muizen PTS-model geïntroduceerd door trombine en lichtgevoelige kleurstof samen te injecteren voor fotoactivering. Het trombine-versterkte PTS-model produceert gemengde bloedplaatjes:fibrinestolsels en is zeer gevoelig voor tPA-trombolyse.

Een fibrine-verrijkt en tPA-gevoelig fototrombotisch beroertemodel

Histotripsy-aided lytic delivery of lysotripsy is in ontwikkeling voor de behandeling van diepe veneuze trombose. Een in vitro procedure wordt hier gepresenteerd om de werkzaamheid van deze combinatietherapie te beoordelen. Belangrijke protocollen voor het stolselmodel, beeldbegeleiding en beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling worden besproken.

Een in vitro systeem om de trombolytische werkzaamheid van histotripsie en een lytisch medicijn te meten

Het huidige protocol beschrijft hoe een FeCl 3-gemedieerd letsel kan worden gebruikt om arteriële trombose te induceren en hoe arteriële letselmonsters in verschillende stadia van trombose kunnen worden verzameld en voorbereid voor elektronenmicroscopieanalyse.

IJzerchloride-geïnduceerde arteriële trombose en monsterverzameling voor 3D-elektronenmicroscopieanalyse

Dit werk beschrijft een microfluissue-assay die schuifspanning gebruikt om de vorming van tromben in het bloed te triggeren en karakteriseert de trombus aan de hand van meerdere dimensies van uitlezen. De test kan de protrombische neiging van bloedmonsters meten en is daardoor nuttig voor ziektediagnose, geneesmiddelenontdekking, evenals basismechanistische studies gerelateerd aan trombose.

Thrombus Profiling Assay: Een op microfludiica gebaseerd platform voor het volledig karakteriseren van biomechanische trombogenese

Leer fibrinolyse volgen met de Chandler loop en RT-FluFF voor trombolyseonderzoek. Deze methode verbetert de fysiologische relevantie van in-vitro stolseloplossing onder stromingsomstandigheden.

Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel

Meer video's verkennen