Name: Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer de differentiatie van osteoclasten van menselijke iPSCs met behulp van biologische factoren en karakteriseringstechnieken. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor botziekteonderzoek en weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de leden van het Giachelli-lab bedanken voor hun technische hulp en ondersteuning. We danken het W. M. Keck Microscopie Centrum en de Keck Center manager, Dr. Nathanial Peters, voor hun hulp bij het verkrijgen van de confocale microscopie en breedveldmicroscopiebeelden. We danken ook de UW Flow Core Facility en de Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, voor technische ondersteuning en assistentie. Tot slot bedanken we Hannah Blümke voor de ondersteuning bij illustratie en grafisch ontwerp.
Financiering werd verstrekt via de National Institutes of Health-subsidie R35 HL139602-01. We erkennen ook NIH S10-subsidie S10 OD016240 voor instrumentfinanciering in het WM Keck Center, evenals NIH-subsidie 1S10OD024979-01A1 voor instrumentfinanciering bij de UW Flow Core Facility.

OPMERKING: Alle reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel. Tenzij anders aangegeven, werden alle media voor gebruik vooraf in evenwicht gebracht tot 37 °C. Alle centrifugatiestappen worden uitgevoerd bij 37 °C en met behulp van de langzaamste acceleratie-/vertragingsmodus. Tenzij anders aangegeven, wordt het supernatans altijd verwijderd met behulp van Pasteur glazen pipetten voor eenmalig gebruik.
1. Ontdooien en vermeerderen van humane iPSC's
<ol><li>Een dag voor het ontdooien van iPSC's, smeer een putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml van een basaal membraanextract in een concentratie van 200-300 μg/ml. Plaats de putplaat een nacht op 4 °C.</li>
	<li>Ontdooi de volgende dag en breng de cellen over in een buisje van 15 ml met behulp van een P1000-pipet. Voeg druppelsgewijs 5-7 ml DMEM/F-12 toe met 15 mM HEPES.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g . Verwijder de cellen voorzichtig uit de centrifuge en zorg ervoor dat u de celpellet niet verstoort.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig met een pasteur-glaspipet en resuspendeer de cellen in 1 ml hiPSC-serumvrij medium (hiPSC-SFM met 10 μM rhokinase (ROCK)-remmer Y-27632) met behulp van P1000 met brede boringspunten.</li>
	<li>Zuig het basale membraanextract van de vorige dag op uit het putje dat is gecoat (stap 1.1) en breng 1 ml hiPSC-SFM met 10 μM Y-27632 over in het putje. Voeg geresuspendeerde iPSC's toe aan het putje om een uiteindelijk volume van 2 ml per putje te bereiken.</li>
	<li>Draai de plaat om de iPSC-aggregaten gelijkmatig te verdelen voordat u deze in een incubator plaatst bij 37 °C en 5% CO2 .</li>
	<li>Voer om de dag volledige mediumveranderingen uit met hiPSC-SFM (zonder toevoeging van ROCK-remmer Y-27632). iPSC's bereiken meestal 70-80% confluentie na 3-4 dagen voortplanting.</li>
</ol>2. iPSC's passeren
<ol><li>Een dag voordat u iPSC's passeert, smeer u de putjes van een plaat met 6 putjes in met een basaalmembraanextract in een concentratie van 200-300 μg/ml. Zet de putplaat een nacht op 4 °C. OPMERKING: Bevestig dat de cellen ongeveer 70-80% confluentie hebben bereikt. Zorg ervoor dat iPSC's niet overconfluent worden (meer dan 80% confluency), omdat dit spontane differentiatie bevordert.</li>
	<li>Begin met het passeren van iPSC's door gedifferentieerde regio's of regio's met veel dode iPSC-aggregaten onder de stereomicroscoop te verwijderen met behulp van pipetpunten van 10 μl of 20 μl of een celschraper. Gedifferentieerde gebieden zullen dichter of witter van kleur lijken. OPMERKING: Afgeschraapte celaggregaten kunnen zich nog steeds gedeeltelijk aan de bodem van de put hechten.</li>
	<li>Was de bodem van de put meerdere keren met een P1000-pipet met brede boring om eventuele aggregaten te verwijderen die nog gedeeltelijk aan de bodem van de put vastzitten.</li>
	<li>Gooi het gebruikte medium weg waarin de iPSC's zijn gekweekt en dat de losse iPSC-aggregaten bevat. Herhaal de wasstap nog twee keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 ml 5 E/ml Dispase per putje toe. Randen van de iPSC-kolonies zullen loskomen van de putplaat, wat na 3-5 minuten incubatie bij kamertemperatuur onder de stereomicroscoop kan worden waargenomen.</li>
	<li>Verwijder Dispase voorzichtig om te voorkomen dat licht losgeraakte aggregaten losraken en voeg 1 ml DMEM/F-12 toe met 15 mM HEPES. Gebruik een wegwerpcelheffer om de aggregaten in kleine maten te snijden. De consistentie van iPSC-aggregaatgroottes kan worden verbeterd met een hulpmiddel voor het passeren van stamcellen.</li>
	<li>Spoel de gesneden iPSC-aggregaten af met het medium in het putje en breng het medium met aggregaten over in een conische buis van 15 ml met behulp van een serologische pipet van 5 ml of P1000 met een brede diameter.</li>
	<li>Spoel het putje af met DMEM/F-12 en breng het medium over naar de 15 ml buis met de iPSC-aggregaten.</li>
	<li>Centrifugeer de gesneden iPSC-aggregaten op 200 x g gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatans met een pasteurglazen pipet en voeg 2 ml hiPSC-SFM toe om de iPSC's los te maken en te resuspenderen met een serologische pipet van 5 ml of P1000 met brede boringspunten.</li>
	<li>Zuig het overgebleven basale membraanextract van de voorgecoate putplaat(en) op en voeg 1 ml hiPSC-SFM toe aan elk putje van de plaat met 6 putjes.</li>
	<li>Breng iPSC's over in nieuwe putjes van een plaat met 6 putjes, zodat het uiteindelijke volume 2 ml hiPSC-SFM per putje is met behulp van een P1000 met brede boringen. Afhankelijk van de iPSC-lijn moeten split-ratio's worden geoptimaliseerd. Hier werd een splitverhouding van 1:6 gebruikt.</li>
	<li>Controleer de put onder de stereomicroscoop op drijvende aggregaten en de grootte van het aggregaat. Idealiter zou de aggregaatgrootte tussen 50-200 μm moeten liggen.</li>
	<li>Draai de putplaat rond om de cellen gelijkmatig over de plaat te verdelen nadat de aggregaten zijn overgebracht en incubeer bij 37 °C bij 5% CO2 tot 70-80% confluentie.</li>
</ol>3. iPSC's terugvriezen
<ol><li>Om iPSC-cellen terug te bevriezen, passeert u cellen zoals hierboven beschreven (zie protocolstap "2. Passaging van iPSC's"). Nadat de cellen in kolonies zijn gesneden en van de bodem van de put zijn afgewassen (stap 2.10), centrifugeert u de gesneden aggregaten gedurende 3 minuten op 200 x g . Aspireer de supernatant.</li>
	<li>Voeg 1 ml serumvrij cryopreservatiemedium per putje van een plaat met 6 putjes toe aan de buis van 15 ml en resuspendeer de gesneden aggregaten met een P1000 met een brede boring.</li>
	<li>Breng cellen over in vooraf gelabelde cryobuizen. Sluit de buizen en breng de buizen over in een voorgekoelde cryopreservatiecontainer bij 4 °C. Bewaar cellen bij -80 °C gedurende 24-48 uur.</li>
	<li>Breng cryovials over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. OPMERKING: Een schematische samenvatting van het OC-differentiatieproces wordt geïllustreerd in figuur 1.</li>
</ol>4. Inductie van het embryoïde lichaam
<ol><li>Cultiveer en breid voldoende iPSC's uit zoals hierboven beschreven voor EB-inductie. OPMERKING: De OC-productie kan worden opgeschaald door het aantal embryoïde lichamen te vergroten, die op hun beurt een algehele hogere opbrengst aan hematopoëtische cellen produceren. Een putje met 70-80% confluente iPSC's levert ongeveer 8,4 x 105 cellen per putje op van een plaatputje met 6 putjes. Er zijn 12.500 eencellige iPSC's nodig om één embryoïde lichaam te vormen.</li>
	<li>Zuig het verbruikte medium uit de iPSC-culturen op en spoel de iPSC-kolonies af met D-PBS.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml voorverwarmd eencellig dissociatiereagens op kamertemperatuur toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes en draai het kweekvat rond om het hele putoppervlak te bedekken. Incubeer het kweekvat bij 37 °C gedurende 5-8 min.</li>
	<li>Haal het vat uit de incubator, zuig het eencellige dissociatiereagens op en voeg 1 ml van het stadium 1-differentiatiemedium toe aan de putjes, bestaande uit hiPSC-serumvrij medium met 50 ng/ml humaan botmorfogenetisch eiwit 4 (hBMP4), 50 ng/ml humaan vasculaire endotheliale groeifactor-165 (hVEGF), 20 ng/ml humane stamcelfactor (hSCF), en 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Maak de cellen voorzichtig los door het putje te spoelen met het Stage 1-medium. Pool gedissocieerde iPSC's in een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Voeg 1 ml fase 1 differentiatiemedium toe aan de putjes en was de resterende cellen eraf of gebruik een celschraper voor kolonies die niet gemakkelijk afwassen.</li>
	<li>Nadat alle cellen in de buis zijn overgebracht, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 200 × g om een celpellet te vormen. Zuig de cellen op en resuspendeer ze in een totaal van 2 ml vooraf geëgaliseerd stadium 1-differentiatiemedium met behulp van een serologische pipet van 5 ml of een P1000 met een brede boring.</li>
	<li>Tel cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerd apparaat voor het tellen van cellen. Voeg het medium toe aan de buis van 15 ml met de eencellige suspensie om 12.500 cellen per putje te plaatsen in een ultralage bevestiging met ronde bodem, een plaat met 96 putjes in 100 μL van het differentiatiemedium van fase 1. OPMERKING: Onder de microscoop verschijnen cellen als een eencellige suspensie met cellen verspreid over de put.</li>
	<li>Centrifugeer de platen met 96 putjes gedurende 3 minuten op 100 x g. Na het centrifugeren zouden cellen onder de microscoop op sferoïden moeten gaan lijken. Plaats de plaat gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C.</li>
	<li>Vervang de helft van het medium op dag 1 en dag 2 met het differentiatiemedium van fase 1. Om de efficiëntie te verbeteren, gebruikt u een meerkanaalspipet om 50 μl van het gebruikte fase 1-differentiatiemedium in een petrischaal te deponeren.</li>
	<li>Nadat u het medium van de plaat met 96 putjes hebt weggegooid, controleert u onder de stereomicroscoop op EB's die mogelijk per ongeluk zijn verwijderd. Breng per ongeluk verwijderde EB's over naar de plaat met 96 putjes met behulp van een P1000-pipet met brede boringspunten.</li>
	<li>Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 50 μl vers fase 1-differentiatiemedium toe aan elk putje van een ultralage plaat met ronde bodem en 96 putjes.</li>
</ol>5. Hematopoëtische differentiatie
<ol><li>Een dag voordat u met de hematopoëtische differentiatie begint, smeer u een putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml van een basaal membraanextract in een concentratie van 200-300 μg/ml. Plaats de putplaat een nacht op 4 °C. OPMERKING: Elke put zal op een later tijdstip van dit protocol 8 EB's ontvangen. Afhankelijk van het aantal voorbereide EB's, bedek de putten dienovereenkomstig.</li>
	<li>Zuig het overtollige basale membraanextract op en vul de putjes van de plaat met 6 putjes voor met 3 ml van het stadium 2-differentiatiemedium, bestaande uit een hematopoëtisch basaal medium waaraan 2 mM Ultraglutamine, 55 μM 2-mercaptoethanol, 25 ng/ml humaan interleukine 3 (hIL-3) en 100 ng/ml humane macrofaagkoloniestimulerende factor (hM-CSF) is toegevoegd.</li>
	<li>Gebruik een P1000 met brede boringen om 8 EB's over te brengen in elk putje van de plaat met 6 putjes. Bevestig na het overbrengen met het oog of onder de stereomicroscoop dat er 8 EB's in elk putje zitten. OPMERKING: Na 1 dag zullen de drijvende EB's zich hechten aan de bodem van de put. In de volgende 5-7 dagen zou een drijvende celpopulatie bestaande uit hematopoëtische cellen zichtbaar moeten worden. De hematopoëtische differentiatieperiode kan worden gevarieerd, te beginnen met 7 dagen. Differentiatie gedurende 10 dagen toonde een hematopoëtische populatie bestaande uit grote CD45+, CD14+ en CD11b+ subpopulaties.</li>
	<li>Voer na 5 dagen behandeling met het stadium 2 differentiatiemedium een mediumverandering uit door het gebruikte medium te verwijderen en in een conische buis van 50 ml te doseren. Pipetteer langzaam om te proberen zo min mogelijk zwevende cellen te verwijderen en de schuifspanning zo laag mogelijk te houden. Pipetteren onder een stereomicroscoop kan helpen voorkomen dat cellen per ongeluk worden verwijderd.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk 1 ml vers Stage 2 differentiatiemedium toe aan de putjes. Om eventuele drijvende hematopoëtische cellen die op dit punt in het differentiatieproces al aanwezig zijn, te herstellen, mag u het afgegeven medium niet weggooien. Draai in plaats daarvan de buis met het verbruikte medium gedurende 5 minuten op 300 x g en zuig het supernatant op.</li>
	<li>Voeg vers stadium 2 differentiatiemedium toe aan de buis en resuspendeer om cellen los te maken die mogelijk met het gebruikte medium zijn overgebracht.</li>
	<li>Voeg 2 ml van het verse fase 2-differentiatiemedium met de herstelde cellen toe aan elk putje, dat eerder was gevuld met 1 ml van het stadium 2-differentiatiemedium.</li>
	<li>Controleer op dag 10 van de hematopoëtische differentiatie op de aanwezigheid van grote aantallen drijvende hematopoëtische cellen. Oogst door ze op te vangen in een tube van 50 ml. Ze kunnen worden ingevroren in 10% DMSO, 50% FBS en 40% medium of onmiddellijk worden gebruikt om de cellen in OC's te differentiëren.</li>
</ol>6. M-CSF-rijping en OC-differentiatie
<ol><li>Zaadcellen in een concentratie van 200.000 cellen/cm2 op weefselkweek behandelde putplaten en behandelen met alfa-MEM, aangevuld met 10% FBS en 50 ng/ml hM-CSF.</li>
	<li>Om functionele assays of beeldvorming uit te voeren, maakt u de M-CSF gerijpte cellen 3 dagen na het zaaien los door ze te wassen met voorverwarmde PBS tot 37 °C met behulp van een P1000 met een brede boring. Herhaalde wasstappen kunnen nodig zijn om cellen volledig los te maken.</li>
	<li>Breng de losgemaakte cellen over in een buis van 15 ml met behulp van een P1000 met een brede diameter en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g . Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Resuspendeer en los de celpellet op met het OC-differentiatiemedium, bestaande uit alfa-MEM aangevuld met 10% FBS, 50 ng/ml hM-CSF en 80 ng/ml hRANKL. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerd celtelapparaat en zaai M-CSF-gerijpte cellen met een dichtheid van 200,00-250,000 cellen/cm2 opnieuw in een geschikt kweekmateriaal voor functionele assays of beeldvorming (d.w.z. botresorptietests, dekglaasjes voor beeldvorming, enz.).</li>
	<li>Differentieer met het OC-differentiatiemedium gedurende 7-9 dagen. Voer elke 2-3 dagen een volledige verandering van het putmedium uit met het verse OC-differentiatiemedium. OPMERKING: Meerkernige OC's verschijnen meestal na 5-7 dagen.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dit protocol biedt een betrouwbare en robuuste methode om iPSC's te differentiëren in OC's. Toch zijn er verschillende valkuilen die zich tijdens het differentiatieproces kunnen voordoen. Menselijke iPSC-lijnen gegenereerd uit cellen van verschillende weefseloorsprong zijn met succes gedifferentieerd met behulp van dit protocol33. Bij het terugvriezen van iPSC's (zie protocolstap "3. Freezing back iPSC's"), werd één put op het punt van passeren weer bevroren in één cryovial. Bij het ontdooien (zie protocolstap "1. Ontdooien en vermeerderen van menselijke iPSC's"), werd één cryovial ontdooid in een enkel putje van een plaat met 6 putjes. Verschillende iPSC-lijnen zullen zich iets anders gedragen en de proliferatiesnelheden zullen variëren. De splitsingssnelheid zal dienovereenkomstig moeten worden aangepast.
Bij het passeren van iPSC's of het dissociëren van iPSC's in een eencellige suspensie voor EB-inductie, is het belangrijk om spontaan gedifferentieerde kolonies of aggregaten van dode cellen te verwijderen om de effectiviteit en efficiëntie van mesodermale en hematopoëtische differentiatie te verbeteren. Dit kan worden gedaan onder een stereomicroscoop met behulp van een celschraper, pipetpunten van een P10- of P20-pipet of een schraapgereedschap gemaakt van een Pasteurpipet35.
Zoals hierboven vermeld, omvat dit protocol de dissociatie van iPSC-kolonies in een eencellige suspensie voor EB-inductie, terwijl bij andere protocollen iPSC's worden achtergelaten als aggregaten die moeten worden gecentrifugeerd voor EB-inductie36. Van EB-grootte, celaantal, vorm en morfologie is gemeld dat ze allemaal van invloed zijn op differentiatie 37,38,39. We veronderstellen dus dat de dissociatie in een eencellige suspensie zorgt voor een betere EB-naar-EB-uniformiteit in grootte en vorm na centrifugatie en dus voor consistentere resultaten van hematopoëtische celproductie31.
Andere methoden voor EB-inductie zijn beschreven. Van dergelijke methoden die een eencellige suspensie gebruiken in combinatie met een ROCK-remmer om de celoverleving te verbeteren, is gemeld dat ze voordelig zijn bij het beheersen van de EB-grootte en de differentiatie-uitkomst31.
De EB-inductiemethode met ronde bodem en 96 putjes die in dit protocol wordt beschreven, is geschikt voor grootschalige productie van EB's en maakt opschaling van OC-productie mogelijk. Onlangs zijn meer nieuwe methoden voor hematopoëtische differentiatie zonder een inductiestap van het embryoïde lichaam beschreven die het differentiatieproces kunnen vergemakkelijken32. Deze protocollen zijn echter nog niet vastgesteld voor de differentiatie van de georganiseerde criminaliteit33.
In het bovengenoemde protocol beschrijven we de gemiddelde verandering op dag 5 van hematopoëtische differentiatie. Een klein aantal zwevende cellen kan al verschijnen rond dag 4-5 van differentiatie. Om te voorkomen dat drijvende cellen worden weggegooid, moet het medium in een buis worden opgevangen en gecentrifugeerd voordat het wordt weggegooid. De celpellet op de bodem van de buis moet vervolgens worden losgemaakt met het verse medium en moet worden teruggebracht naar putjes van een plaat met 6 putjes. De betekenis van de vroege zwevende celpopulatie in OC-differentiatie moet echter nog worden bepaald.
De productie van hematopoëtische cellen kan worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. Hoge opbrengsten van CD45+, CD14+ en CD11b+ cellen zijn wenselijk voor osteoclastdifferentiatie33. Cryopreservatie van geoogste drijvende hematopoëtische cellen is naar verluidt een uitdaging met over het algemeen beperkte herstelpercentages en een lage levensvatbaarheid van de cellen40,41. Door hematopoëtische cellen te cryopreservatie in een cryopreservatiemedium dat bestaat uit 50% van een serumvrij hematopoëtisch celexpansiemedium (zie Materiaaltabel), 40% FBS en 10% DMSO, waren we in staat om cellen te herstellen met een cellevensvatbaarheid van ongeveer 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) na ontdooiing.
Osteoclastogenese vereist de fusie van meerdere eenkernige OC-precursoren om meerkernige osteoclasten te vormen die in staat zijn tot minerale en botresorptie. Terwijl muizen OC-precursorcellijnen alleen de toevoeging van RANKL nodig hebben om OC-vorming te induceren42, hebben menselijke precursoren extra M-CSF nodig voor celoverleving en proliferatie43. OSCAR is onlangs ontdekt als een extra receptor die betrokken is bij OC-differentiatie, hoewel tot nu toe alleen type I collageen is geïdentificeerd als een ligand. Hoewel het onderzoek naar OSCAR met iPSC-afgeleide OC's nog beperkt is, lijken suprafysiologische in vitro RANKL- en M-CSF-concentraties in een muizencellijn de noodzaak van OSCAR-activering te omzeilen44, activering van OSCAR in vivo lijkt een noodzakelijk kostensignaal te zijn voor osteoclastogenese45. Een extra factor waarmee rekening moet worden gehouden, is het oppervlak van de putplaat. Van chemische46 en fysische47 oppervlakte-eigenschappen is bekend dat ze de differentiatie van osteoclasten beïnvloeden en een succesvolle differentiatie kunnen bevorderen of belemmeren. Een zekere heterogeniteit binnen de precursorpopulatie lijkt ook van cruciaal belang voor een succesvolle fusie van OC's, aangezien verschillende fusiegerelateerde factoren zoals CD47 en DC-STAMP in verschillende stadia van osteoclastfusie werken48.
Concluderend kan worden gesteld dat dit protocol het mogelijk maakt om onderscheid te maken tussen menselijke OC en iPSC's om OC-onderzoek te vergemakkelijken en te versnellen.

Osteoclasten (OC's) zijn hematopoëtische 1,2, veelzijdige celtypen die vaak worden gebruikt door onderzoekers op gebieden zoals onderzoek naar botziekten 3,4, kankeronderzoek 5,6, weefselmanipulatie 7,8 en endoprotheseonderzoek 9,10. Niettemin kan differentiatie van OC een uitdaging zijn, aangezien fusie van mononucleaire precursoren tot meerkernige OC's noodzakelijk is om functionele OC's te creëren11. Verschillende biologische factoren, zoals receptoractivator van NF-KB-ligand (RANKL) en macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF), zijn nodig voor OC-differentiatie. Van M-CSF is gemeld dat het een positief effect heeft op celproliferatie, celoverleving en RANK-expressie 12,13,14. Aan de andere kant bindt RANKL zich aan RANK, dat stroomafwaartse signaalcascades activeert die osteoclastogenese induceren. Activering wordt gemedieerd via TNF-receptor-geassocieerde factor 6 (TRAF6), wat leidt tot de afbraak van de nucleaire factor van kappa light polypeptide genversterker in B-celremmer, alfa (IκB-α), een bindend eiwit dat NF-kB-dimerenbindt 16,17. Vandaar dat bij de afbraak van IκB-α NF-kB-dimeren vrijkomen, die vervolgens in de kern worden verplaatst en de expressie van de transcriptiefactoren c-Fos en Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1) induceren. Dit activeert op zijn beurt de transcriptie van een groot aantal OC-differentiatie-gerelateerde eiwitten15,18. Opgereguleerde eiwitten zoals DC-Stamp en Atp6v0d2 mediëren cel-celfusie van OC-precursoren, wat leidt tot syncytiumvorming 19,20,21.
Met betrekking tot menselijke primaire cellen zijn CD34+ en CD14+ PBMC's momenteel de meest gebruikte celtypen voor differentiatie in OC's22. Deze aanpak wordt echter beperkt door de heterogeniteit binnen de CD34+- populatie van geoogste cellen van donoren23 en hun beperkte uitbreidbaarheid. Menselijke iPSC's vormen een alternatieve bron voor OC's. Omdat ze onbeperkt kunnen worden vermeerderd24, maken ze uitbreidbaarheid en opschaling van de OC-productie mogelijk. Dit maakt het mogelijk om grote aantallen OC's te differentiëren, wat OC-onderzoek vergemakkelijkt.
Er zijn verschillende protocollen gepubliceerd voor de differentiatie van iPSC's in OC's 25,26,27. Het hele differentiatieproces kan worden onderverdeeld in een iPSC-propagatiegedeelte, een mesodermale en hematopoëtische differentiatie-deel en OC-differentiatie. Propagatie van iPSC's vóór het differentiatieproces maakt het mogelijk om de OC-productie op te schalen voorafgaand aan de differentiatie. Er bestaan verschillende benaderingen met betrekking tot mesodermale en hematopoëtische differentiatie. Traditioneel wordt de vorming van embryoïde lichamen (EB) gebruikt om hematopoëtische cellen te differentiëren, maar op monolagen gebaseerde benaderingen vertegenwoordigen een andere hematopoëtische differentiatiestrategie waarvoor geen EB-inductie nodig is. Desalniettemin lijken op monolagen gebaseerde systemen verdere optimalisatie te vereisen, aangezien wij en anderen hebben vastgesteld dat EB-gebaseerde benaderingen robuuster zijn voor de differentiatie van OC's.
Hier beschrijven we de differentiatie van OC's van menselijke iPSC's met behulp van een EB-gebaseerd protocol. Dit protocol is aangepast van Rössler et al.26 en aangepast om de robuustheid te vergroten en cryopreservatie tijdens het differentiatieproces mogelijk te maken. Eerst oogstten we hematopoëtische cellen slechts één keer na 10 dagen differentiatie. Hematopoëtische cellen werden vervolgens gecryopreserveerd om meer flexibiliteit tijdens het differentiatieproces mogelijk te maken. Daarnaast verhoogden we de kiemdichtheid van de hematopoëtische cellen van 1 x 105 naar 2 x 105 cellen/cm2 voor OC-differentiatie. Er werd gebruik gemaakt van een recenter humaan iPSC-serumvrij medium (hiPSC-SFM, zie Materiaaltabel) en de putjes werden gecoat met 200-300 μg/ml van een basaalmembraanextract (zie Materiaaltabel) in plaats van 0,1% gelatine. Penicilline/streptomycine werd niet aan de media toegevoegd.
Het protocol van Rössler et al.26 was oorspronkelijk aangepast van een iPSC naar een macrofaagdifferentiatieprotocol28 dat EB-vorming gebruikt voor hematopoëtische differentiatie. Hoewel EB-vorming al langere tijd door onderzoekers wordt gebruikt voor hematopoëtische differentiatie29,30, zijn er in de literatuur verschillende methoden van EB-inductie beschreven, zoals spontane aggregatie, centrifugatie in een putplaat met ronde bodem, hangende druppelcultuur, bioreactorcultuur, conische buiscultuur, langzaam draaiend lateraal vat en micromold-gelcultuur31. Dit protocol maakt gebruik van centrifugatie van gedissocieerde iPSC's in een putplaat met ronde bodem om afzonderlijke iPSC-cellen dicht bij elkaar te brengen en bolvorming (EB) mogelijk te maken, zoals hieronder beschreven.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - Anti-Cathepsin K&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, &kappa; Isotype Control</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&amp;L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b</td><td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, &kappa; Isotype Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr><tr><td>Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43</td><td>BD</td><td>563521</td><td></td></tr><tr><td>Bone Resorption Assay Kit</td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automated Cell Counter</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>R&amp;D Sytems</td><td>3434-010-02</td><td>Basal membrane extract</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (5 U/mL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td><td>Stem Cell</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-3</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-&kappa;B Ligand (hsRANKL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>Human Stem Cell Factor (hSCF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, nucleosides, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05855</td><td>Serum free cryopreservation medium</td></tr><tr><td>mTeSR Plus medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>Round bottom ultra-low attachment 96-well plate</td></tr><tr><td>P1000 Wide Bore Tips</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>StemCell</td><td>09650</td><td>Hematopoietic cell culture medium</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>12563011</td><td>Single-cell dissociation reagent</td></tr><tr><td>Ultraglutamine</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Hematopoietic basal medium</td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well High</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dit protocol beschrijft de voortplanting en passaging van humane iPSC's en hun differentiatie in osteoclasten. Eerst worden iPSC's gedissocieerd in een eencellige suspensie voor verder gebruik bij embryoïde lichaamsinductie. Na mesodermale inductie ondergaan embryoïde lichamen hematopoëtische differentiatie, waardoor een drijvende hematopoëtische celpopulatie ontstaat. Vervolgens ondergaan de geoogste hematopoëtische cellen een macrofaagkolonie-stimulerende factorrijpingsstap en ten slotte osteoclastdifferentiatie. Na osteoclastdifferentiatie worden osteoclasten gekenmerkt door kleuring voor TRAP in combinatie met een methylgroene nucleaire kleuring. Osteoclasten worden waargenomen als meerkernige, TRAP+ polykaryonen. Hun identificatie kan verder worden ondersteund door Cathepsine K-kleuring. Bot- en mineraalresorptietesten maken functionele karakterisering mogelijk, waardoor de identiteit van bonafide osteoclasten wordt bevestigd. Dit protocol demonstreert een robuuste en veelzijdige methode om menselijke osteoclasten te onderscheiden van iPSC's en maakt een gemakkelijke toepassing mogelijk in toepassingen die grote hoeveelheden functionele menselijke osteoclasten vereisen. Toepassingen op het gebied van botonderzoek, kankeronderzoek, weefselmanipulatie en endoprotheseonderzoek kunnen worden overwogen.

Monitoring van de celmorfologie gedurende het hele differentiatieproces Alle hieronder beschreven resultaten zijn gegenereerd met behulp van de MCND-TENS2 iPSC-lijn voor OC-differentiatie. Deze iPSC-lijn is eerder gebruikt in verschillende onderzoeken 32,33. Toch zijn er ook andere iPSC-lijnen met succes gebruikt met dit differentiatieprotocol.
Regelmatige visuele beoordeling onthult verschillende en verschillende morfologische kenmerken van iPSC's gedurende het differentiatieproces naar OC's (Figuur 2). iPSC-kolonies (Figuur 2A) werden gedissocieerd in een eencellige suspensie, die vóór het centrifugeren als individuele cellen in de ronde bodemputplaat verschijnt (Figuur 2B). Na centrifugatie (stap 4.9 in het protocol) verzamelen cellen zich in het midden van de ultralage bevestigingsputplaat met ronde bodem en vormen vervolgens bolletjes (embryoïde lichamen, EB's, figuur 2C). EB's zullen twee tot drie keer in omvang toenemen tijdens het mesodermale differentiatieproces (Figuur 2D) en worden gemakkelijk zichtbaar voor het oog aan het einde van de 4-daagse differentiatieperiode (Figuur 2E). EB's kunnen worden gezien die zich hechten aan en versmelten met de bodem van de putplaat na de overdracht in putten van een plaat met 6 putjes voor hematopoëtische differentiatie (stap 5.3 in het protocol, figuur 2F). Na 7-8 dagen worden grote hoeveelheden drijvende hematopoëtische cellen zichtbaar in het kweekmedium (Figuur 2G). Na het oogsten en vervangen van hematopoëtische cellen volgt een M-CSF-rijpingsfase en wordt OC-differentiatie geïnitieerd (stap 6.4 in het protocol). Binnen 5-6 dagen worden voor het eerst meerkernige cellen met een groot transparant cellichaam zichtbaar (Figuur 2H). In dit stadium is nog een groot aantal mononucleaire cellen zichtbaar. Na nog 2-3 dagen van OC-differentiatie zullen OC's verder fuseren met aangrenzende cellen om grote polykarionen te vormen met nog meer kernen (Figuur 2I).
Beoordeling van de EB-afgeleide hematopoëtische populatie Hematopoëtische differentiatie kan gedurende een variabele tijdsduur worden uitgevoerd. In de literatuur zijn tijdsperioden beschreven die beginnen met 7 dagen tot en met 9 weken. In dit protocol wordt hematopoëtische differentiatie uitgevoerd gedurende een periode van 10 dagen. We ontdekten dat 10 dagen hematopoëtische differentiatie lage aantallen vroege CD34+ (0,53%, figuur 3A) en een groter aantal hematopoëtische voorlopercellen in het middenstadium opleverde. Belangrijker is dat na een behandelingsperiode van 10 dagen voldoende hoeveelheden CD45+ (96,2%, Figuur 3C), CD14+ (33%, Figuur 3D) en CD11b+ (35,9%, Figuur 3E) HPC's werden gegenereerd om ze met succes verder te differentiëren in OC's. Het is echter mogelijk dat de cytokinebehandelingsperiode voor hematopoëtische differentiatie (stap 5.4 in het protocol) moet worden aangepast en geoptimaliseerd op basis van de iPSC-lijn om voldoende hoeveelheden CD45+-, CD14+- en CD11b+-cellen te genereren.
Gemiddeld werden 6 miljoen hematopoëtische cellen geoogst na 10 dagen differentiatie van elk putje met 8 EB's.
Beoordeling van OC-morfologie en -activiteit Na OC-differentiatie kunnen OC's morfologisch en functioneel worden beoordeeld. OC-precursoren worden opnieuw ingezaaid op kamerobjectglaasjes of dekglaasjes na de M-CSF-rijpingsstap om de beeldkwaliteit te verbeteren bij kleuring voor TRAP of Cathepsine K. Enzymatische TRAP-kleuring na OC-differentiatie toont grote, meerkernige, TRAP-positieve OC's (Figuur 4A). Bovendien zijn licht TRAP-positieve mononucleaire cellen te zien, afgewisseld tussen multinucleaire OC's. Negatieve controles zonder toevoeging van RANKL geven geen gefuseerde multinucleaire OC weer. Niettemin kan een klein aantal licht TRAP-positieve mononucleaire cellen worden afgebeeld (Figuur 4B).
Confocale laserscanmicroscopie (CLSM)-beelden tonen OC's die zijn gekleurd voor Cathepsine K (turkoois) en F-actine (rood) in combinatie met DAPI-nucleaire kleuring (blauw) (Figuur 4C, 4D). Grote multinucleaire OC's zijn zichtbaar wanneer ze worden behandeld met RANKL volgens het protocol, dat een uitgebreide F-actine-cytoskeletstructuur weergeeft en positief kleurt voor Cathepsine K (Figuur 4C). Negatieve controles zonder toevoeging van RANKL vertonen daarentegen geen gefuseerde multinucleaire cellen.
OC's kunnen functioneel verder worden beoordeeld door de resorptieve activiteit te meten. Bot- of mineraalresorptietesten kunnen worden gebruikt om de resorptieve activiteit te bepalen. Hier werden OC-precursoren gezaaid op met calciumfosfaat beklede putten en terminaal gedifferentieerd. Grote gebieden waar de minerale coating werd geresorbeerd, zijn zichtbaar in een blauwgrijze kleur (Figuur 4E). Er kunnen resorptieputten van verschillende grootte worden geïdentificeerd. Niet geresorbeerd, de resterende calciumfosfaatlaag is zichtbaar in bruin. De aanwezigheid van resorptieputten bevestigt de identiteit van de gedifferentieerde meerkernige cellen als OC's. Bovendien kunnen resorptieputten verder worden gekwantificeerd om de resorptieve activiteit te beoordelen en te vergelijken. De totale oppervlakte van het geresorbeerde mineraal over het totale oppervlak van de put kan worden gekwantificeerd als een procentuele maatstaf. Bovendien kunnen de grootte en het aantal resorptieputten verder worden gekwantificeerd. Onbehandelde negatieve controles vertoonden geen resorptieputjes (Figuur 4F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische illustratie van het osteoclastdifferentiatieproces van humane iPSC's. Illustratie getekend door Hannah Blümke met Affinity Designer 2.1.1. De illustratie maakt gebruik van eerder gebruikte tekeningen33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg"> Figuur 2: Microscopiebeelden gedurende het differentiatieproces van menselijke iPSC's naar osteoclasten. (A) Ongedifferentieerde iPSC-kolonies tijdens de voortplanting. (B) iPSC's in putjes met ronde bodem na dissociatie in een eencellige suspensie voorafgaand aan centrifugeren. (C) Centraal verzamelde eencellige iPSC's na centrifugeren. (D) EB's groeien in omvang gedurende de 4-daagse mesodermale differentiatieperiode. (E) Zichtbare embryoïde lichamen na mesodermale differentiatie. (F) Na de overdracht van embryoïde lichamen op met basaal membraanextract beklede platen met 6 putjes, kunnen embryoïde lichamen worden gezien die zich hechten aan en versmelten met de putbodem. (G) Na 5-7 dagen hematopoëtische differentiatie kan een groot aantal zwevende hematopoëtische cellen in het medium worden waargenomen. (H) Na rijping van M-CSF verschijnen de eerste osteoclasten met 3-4 kernen na 5-7 dagen differentiatie met RANKL. (I) Aan het einde van de osteoclastdifferentiatie kunnen grote meerkernige cellen worden waargenomen. Schaalbalken: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg"> Figuur 3: Oppervlaktemarkeranalyse van van embryoïde lichaam-afgeleide hematopoëtische cellen met behulp van flowcytometrie. Markerexpressie maakt de analyse van hematopoëtische cellen en identificatie van subpopulaties na gating voor singlets en levende cellen mogelijk. (A) Ontogenetisch vroege CD34+ hematopoëtische voorlopercelpopulatie is zeer klein tot afwezig in combinatie met dit protocol. (B) CD43+- cellen vormen ongeveer 50% van de gehele populatie. (C) CD45+ hematopoëtische voorlopercellen in een later stadium vormen met 96,2% het grootste deel van de hematopoëtische populatie. (D, E) Meer directe CD14+ en CD11b+ OC-precursoren zijn goed voor respectievelijk 33% en 36%. In rood: ongekleurde negatieve controle, in blauw: isotypecontroles, in geel: cellen gekleurd met het respectieve markerantilichaam. De waarnemingspunten zijn gebaseerd op eerder gepubliceerde gegevens33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg"> Figuur 4: Morfologische en functionele beoordeling van iPSC-gedifferentieerde humane osteoclasten. (A) TRAP-kleuring na osteoclastdifferentiatie toont grote, meerkernige, TRAP-positieve osteoclasten. Licht TRAP-positieve mononucleaire cellen zijn te zien afgewisseld tussen multinucleaire osteoclasten. (B) Negatieve controles zonder toevoeging van RANKL gekleurd voor TRAP vertonen geen gefuseerde multinucleaire osteoclasten. Niettemin kan een klein aantal licht TRAP-positieve, mononucleaire cellen worden afgebeeld. (C) Confocale laserscanmicroscopiebeelden van osteoclast gedifferentieerde hematopoëtische cellen op een dekglaasje gekleurd voor F-actine (rood) en Cathepsine K (turkoois) in combinatie met DAPI nucleaire kleuring (blauw) tonen grote meerkernige Cathepsine K-positieve osteoclasten. (D) Negatieve controles zonder toevoeging van RANKL vertonen gelijkenis met (B) mononucleaire cellen bij een lagere celdichtheid. (E) Functionele beoordeling kan worden uitgevoerd door de resorptieactiviteit van osteoclasten te beoordelen. Hiervoor wordt osteoclastdifferentiatie uitgevoerd op een bot- of mineraalresorptietest. Betegelde putbeelden verkregen met een omgekeerde breedveldmicroscoop in fasecontrastmodus tonen grote resorptiegebieden van de calciumfosfaatmineraallaag. De resorptieactiviteit kan verder worden gekwantificeerd door het resorptiegebied over het totale oppervlak te meten. (F) Negatieve controles zonder toevoeging van RANKL vertonen geen resorptiegebieden. Schaalbalken: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Afbeeldingen zijn bewerkt op basis van eerder gepubliceerde gegevens33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Inleiding.Osteoclasten zijn een meerkernig celtype dat vaak wordt gebruikt door onderzoekers op gebieden zoals onderzoek naar botziekten, kankeronderzoek, weefselmanipulatie en endoprotheseonderzoek. Niettemin kan osteoclastdifferentiatie een uitdaging zijn, omdat fusie van precursoren noodzakelijk is. Bovendien vereist differentiatie van menselijke osteoclasten van IPSC's het gebruik van een verscheidenheid aan biologische factoren op het juiste moment.Als het gaat om menselijke primaire cellen. CD34+perifere mononucleaire bloedcellen zijn momenteel het meest gebruikte celtype voor de differentiatie in osteoclasten. Deze benadering wordt echter beperkt door de heterogeniteit binnen de CD34+-populatie en hun beperkte uitbreidbaarheid.Humane IPSC's vormen een alternatieve bron voor osteoclasten. Omdat ze voor onbepaalde tijd kunnen worden vermeerderd, zorgen ze voor uitbreidbaarheid en opschaling van de productie van osteoclasten. Dit maakt differentiatie van grote aantallen osteoclasten mogelijk, wat osteoclastenonderzoek vergemakkelijkt.Hier demonstreren onze postdoc Alexander Blumke en promovendus Jessica Simon de differentiatie van osteoclasten van menselijke IPSC's die IPSC's passeren. Begin met het passeren van IPSC's door gedifferentieerde regio's of regio's met veel dode IPSC-aggregaten onder de stereomicroscoop te verwijderen met behulp van een P-10 of P-20 pipetpunt of een celschraper. Gedifferentieerde gebieden zullen dichter en witter van kleur lijken.Was de losgemaakte cellen los met oud medium en was vervolgens alle resterende losgemaakte cellen twee keer weg met PBS. Voeg vervolgens een milliliter van vijf eenheden per milliliter dispase per putje toe aan het putje. De randen van de kolonies die loskomen van de schotel kunnen na drie tot vijf minuten onder de stereomicroscoop worden waargenomen.Verwijder voorzichtig de dispase en voeg een milliliter DMEM/F-12 met 15 millimolaire HEPES toe. Gebruik een hulpmiddel voor het doorgeven van stamcellen of een wegwerpcellifter om de aggregaten in klein formaat te snijden. Breng de media met aggregaten over in een conische buis van 15 milliliter met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter of een P-1000 met brede diameter.Spoel de put met DMEM/F-12 en breng media over naar de buis van 15 milliliter. Centrifugeer de gesneden IPSC-aggregaten gedurende drie minuten bij 200 G. Verwijder het supernatans met een pasteur-glazen pipet en voeg twee milliliter humaan IPSC-serumvrij medium toe om de IPSC's los te maken en opnieuw te suspenderen met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter of P-1000 met brede uitsteekpunten.Zuig het overgebleven basale membraanextract van de voorgecoate putplaten op en voeg één milliliter humaan IPSC-serumvrij medium toe aan elk putje van de plaat met zes putjes. Breng IPSC's over in nieuwe putjes van een plaat met zes putjes, zodat het uiteindelijke volume twee milliliter humaan IPSC-serumvrij medium per put is met behulp van een P-1000 met brede uiteinden. Afhankelijk van de IPSC-lijn moeten de split-ratio's worden geoptimaliseerd.Hier werd een splitverhouding van 1:6 gebruikt. Draai de putplaat rond om de cellen gelijkmatig over de plaat te verdelen nadat de aggregaten zijn overgebracht. Embryoïde lichaamsinductie.Zuig het oude medium uit de IPSC-culturen op en spoel de putjes met DPBS. Voeg een halve milliliter voorverwarmd tot kamertemperatuur toe aan elk putje van een plaat met zes putjes en draai het kweekvat rond om het hele putoppervlak te bedekken. Incubeer het kweekvat gedurende vijf tot acht minuten bij 37 graden C.Haal het vat uit de incubator, zuig de oplossing op en voeg fase één medium toe aan putjes bestaande uit 50 nanogram per milliliter humaan bot morfogeen eiwit 4, 50 nanogram per milliliter humaan vasculair endotheliale groeifactor 165, 20 nanogram per milliliter menselijke stamcelfactor en 10 micromolaire ROCK-remmer Y-27632. Maak de cellen voorzichtig los door het putje te spoelen met stadium één medium. Trek de cellen in een conische buis.Voeg een nieuw medium toe aan de putjes en maak alle resterende cellen los met behulp van een celschraper. Nadat alle cellen in de buis zijn overgebracht, centrifugeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 200 G om de cellen te pelleteren. Zuig de cellen op en resuspendeer ze in een totaal van twee milliliter vooraf gebalanceerd fase één medium.Tel cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerd celtelapparaat Zaad 12.500 cellen per putje in een ultralage plaat met 96 putjes met ronde bodem in 100 microliter stadium één medium. Onder de microscoop verschijnen cellen diffuus door de oplossing. Centrifugeer de platen met 96 putjes gedurende drie minuten bij 100 G Na het centrifugeren moeten de cellen onder de microscoop op sferoïden gaan lijken.Plaats de plaat in een incubator van 37 graden C. Verander de helft van het medium op dag één en dag twee met fase één media. Gebruik een multikanaalspipet om oud medium in een petrischaaltje te gieten.Controleer na het weggooien van media van de plaat met 96 putjes op EB's die mogelijk per ongeluk zijn verwijderd. Breng de per ongeluk verwijderde EB's in de petrischaal terug over met behulp van een P-1000 pipet Hematopoëtische differentiatie. Vul putjes van een plaat met zes putjes vooraf met drie milliliter stadium twee medium, waaraan twee millimolair ultraglutamine, 55 micromolair bèta-mercaptoethanol, 25 nanogram per milliliter, humaan interleukine-3 en 100 nanogram per milliliter menselijke macrofaagkoloniestimulerende factor wordt toegevoegd.Gebruik een P-1000 en een tip met brede boring om acht EB's over te brengen in elk putje van de plaat met zes putjes. Controleer na het overbrengen met het oog onder de stereomicroscoop of er acht EB's in elk putje zitten. Na vijf tot zeven dagen zou een drijvende celpopulatie bestaande uit hematopoëtische cellen zichtbaar moeten worden.De hematopoëtische differentiatieperiode kan worden gevarieerd, te beginnen met zeven dagen. Differentiatie gedurende 10 dagen toonde een hematopoëtische populatie bestaande uit grote CD45+CD14+en CD11b+subpopulaties. Voer na vijf dagen behandeling met medium in fase twee een mediumwissel uit door het oude medium voorzichtig te verwijderen en in een conische buis van 50 milliliter te doseren.Voeg onmiddellijk een milliliter nieuw stadium twee medium toe aan de putjes. Om eventueel al aanwezige drijvende hematopoëtische cellen te sparen, draait u de buis met het oude medium gedurende vijf minuten rond bij 300 G. Voeg nieuw medium van fase twee toe aan de buis en resuspendeer om cellen los te maken die mogelijk met het oude medium zijn overgedragen.Voeg twee milliliter nieuw stadium twee medium met opgeslagen cellen toe aan elk putje, dat voorheen gevuld was met één milliliter stadium twee medium. Op dag 10 van de hematopoëtische differentiatie worden drijvende hematopoëtische cellen geoogst door ze te verzamelen in een conische buis van 50 milliliter en kunnen ze ofwel worden ingevroren met behulp van 10% DMSO, 50% FBS en 40% medium, of onmiddellijk worden gebruikt om cellen verder te differentiëren tot osteoclasten. M-CSF-rijping en osteoclastdifferentiatie.Zaadcellen met 200.000 cellen per vierkante centimeter en gedurende drie dagen behandelen met alfa MEM aangevuld met 10% FBS en 50 nanogram per milliliter M-CSF. Om functionele assays of beeldvorming uit te voeren, maakt u de MCSF-gerijpte cellen los door ze te wassen met een P-1000 met brede diameter. Breng losgemaakte cellen met oud medium over in een buis en draai ze gedurende vijf minuten rond bij 300 G.Resuspendeer en los de celpellet op met verse alfa-MEM aangevuld met 10% FBS, 50 nanogram per milliliter M-CSF en 80 nanogram per milliliter RANK-ligand. Zaai de cellen opnieuw in met 200.000 cellen per vierkante centimeter en differentieer gedurende zeven tot negen dagen. Meerkernige osteoclasten verschijnen meestal rond dag vijf tot zeven.Representatieve resultaten. De samenstelling van de gegenereerde hematopoëtische celpopulatie kan worden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Hier vertonen hematopoëtische cellen een grote populatie CD45+-voorlopercellen.Celpopulaties die de monocytmarkers CD14 en CD11b tot expressie brengen, vormen meestal een derde van de gehele populatie in vergelijking met isotypecontroles. Terminaal gedifferentieerde IPSC-afgeleide osteoclasten kunnen onder de microscoop worden bekeken als TRAP-positieve meerkernige cellen. Confocale microscopie toont celkleuring voor cathepsine K. Functionele assays zoals bot- of mineraalabsorptieassays maken verdere kwantificering van osteoclastactiviteit mogelijk.Hier zijn resorptieputten zichtbaar na het verwijderen van rijpe osteoclasten met 10% bleekmiddel voorafgaand aan beeldvorming, terwijl M-CSF-gerijpte osteoclastprecursoren die zijn behandeld zonder toevoeging van RANK-ligand geen resorptieputten vertonen. Conclusie. Dit protocol maakt de robuuste en betrouwbare differentiatie van menselijke osteoclasten mogelijk en zou een kant-en-klare oplossing kunnen bieden voor botziekten of ziekten waarbij sprake is van overmatige verkalking. We gebruiken osteoclasten om ze verder te ontwikkelen in onze RANK-cellen die een intracellulair signaaldomein gebruiken dat kan worden geactiveerd in combinatie met een chemische inductor van dimerisatie voor gecontroleerde en osteoprotegerine-onafhankelijke osteoclastactivering.

differentiation-characterization-osteoclasts-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van Li-Fraumeni syndroom (LFS) patiënt afgeleide fibroblasten, differentiatie van iPSCs via mesenchymale stamcellen (MSCs) botcellen te modelleren in vivo tumorigenesis met behulp van LFS patiënt afkomstige botcellen.

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC's in mesenchymale stromale cellen (MSC's). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB's) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.

Vergelijking van twee representatieve methoden voor differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in mesenchymale stromale cellen

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer de differentiatie van osteoclasten van menselijke iPSCs met behulp van biologische factoren en karakteriseringstechnieken. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor botziekteonderzoek en weefselengineering.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen