Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Inleiding.Osteoclasten zijn een meerkernig celtype dat vaak wordt gebruikt door onderzoekers op gebieden zoals onderzoek naar botziekten, kankeronderzoek, weefselmanipulatie en endoprotheseonderzoek. Niettemin kan osteoclastdifferentiatie een uitdaging zijn, omdat fusie van precursoren noodzakelijk is. Bovendien vereist differentiatie van menselijke osteoclasten van IPSC's het gebruik van een verscheidenheid aan biologische factoren op het juiste moment.

Als het gaat om menselijke primaire cellen. CD34+perifere mononucleaire bloedcellen zijn momenteel het meest gebruikte celtype voor de differentiatie in osteoclasten. Deze benadering wordt echter beperkt door de heterogeniteit binnen de CD34+-populatie en hun beperkte uitbreidbaarheid.

Humane IPSC's vormen een alternatieve bron voor osteoclasten. Omdat ze voor onbepaalde tijd kunnen worden vermeerderd, zorgen ze voor uitbreidbaarheid en opschaling van de productie van osteoclasten. Dit maakt differentiatie van grote aantallen osteoclasten mogelijk, wat osteoclastenonderzoek vergemakkelijkt.

Hier demonstreren onze postdoc Alexander Blumke en promovendus Jessica Simon de differentiatie van osteoclasten van menselijke IPSC's die IPSC's passeren. Begin met het passeren van IPSC's door gedifferentieerde regio's of regio's met veel dode IPSC-aggregaten onder de stereomicroscoop te verwijderen met behulp van een P-10 of P-20 pipetpunt of een celschraper. Gedifferentieerde gebieden zullen dichter en witter van kleur lijken.

Was de losgemaakte cellen los met oud medium en was vervolgens alle resterende losgemaakte cellen twee keer weg met PBS. Voeg vervolgens een milliliter van vijf eenheden per milliliter dispase per putje toe aan het putje. De randen van de kolonies die loskomen van de schotel kunnen na drie tot vijf minuten onder de stereomicroscoop worden waargenomen.

Verwijder voorzichtig de dispase en voeg een milliliter DMEM/F-12 met 15 millimolaire HEPES toe. Gebruik een hulpmiddel voor het doorgeven van stamcellen of een wegwerpcellifter om de aggregaten in klein formaat te snijden. Breng de media met aggregaten over in een conische buis van 15 milliliter met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter of een P-1000 met brede diameter.

Spoel de put met DMEM/F-12 en breng media over naar de buis van 15 milliliter. Centrifugeer de gesneden IPSC-aggregaten gedurende drie minuten bij 200 G. Verwijder het supernatans met een pasteur-glazen pipet en voeg twee milliliter humaan IPSC-serumvrij medium toe om de IPSC's los te maken en opnieuw te suspenderen met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter of P-1000 met brede uitsteekpunten.

Zuig het overgebleven basale membraanextract van de voorgecoate putplaten op en voeg één milliliter humaan IPSC-serumvrij medium toe aan elk putje van de plaat met zes putjes. Breng IPSC's over in nieuwe putjes van een plaat met zes putjes, zodat het uiteindelijke volume twee milliliter humaan IPSC-serumvrij medium per put is met behulp van een P-1000 met brede uiteinden. Afhankelijk van de IPSC-lijn moeten de split-ratio's worden geoptimaliseerd.

Hier werd een splitverhouding van 1:6 gebruikt. Draai de putplaat rond om de cellen gelijkmatig over de plaat te verdelen nadat de aggregaten zijn overgebracht. Embryoïde lichaamsinductie.

Zuig het oude medium uit de IPSC-culturen op en spoel de putjes met DPBS. Voeg een halve milliliter voorverwarmd tot kamertemperatuur toe aan elk putje van een plaat met zes putjes en draai het kweekvat rond om het hele putoppervlak te bedekken. Incubeer het kweekvat gedurende vijf tot acht minuten bij 37 graden C.

Haal het vat uit de incubator, zuig de oplossing op en voeg fase één medium toe aan putjes bestaande uit 50 nanogram per milliliter humaan bot morfogeen eiwit 4, 50 nanogram per milliliter humaan vasculair endotheliale groeifactor 165, 20 nanogram per milliliter menselijke stamcelfactor en 10 micromolaire ROCK-remmer Y-27632. Maak de cellen voorzichtig los door het putje te spoelen met stadium één medium. Trek de cellen in een conische buis.

Voeg een nieuw medium toe aan de putjes en maak alle resterende cellen los met behulp van een celschraper. Nadat alle cellen in de buis zijn overgebracht, centrifugeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 200 G om de cellen te pelleteren. Zuig de cellen op en resuspendeer ze in een totaal van twee milliliter vooraf gebalanceerd fase één medium.

Tel cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerd celtelapparaat Zaad 12.500 cellen per putje in een ultralage plaat met 96 putjes met ronde bodem in 100 microliter stadium één medium. Onder de microscoop verschijnen cellen diffuus door de oplossing. Centrifugeer de platen met 96 putjes gedurende drie minuten bij 100 G Na het centrifugeren moeten de cellen onder de microscoop op sferoïden gaan lijken.

Plaats de plaat in een incubator van 37 graden C. Verander de helft van het medium op dag één en dag twee met fase één media. Gebruik een multikanaalspipet om oud medium in een petrischaaltje te gieten.

Controleer na het weggooien van media van de plaat met 96 putjes op EB's die mogelijk per ongeluk zijn verwijderd. Breng de per ongeluk verwijderde EB's in de petrischaal terug over met behulp van een P-1000 pipet Hematopoëtische differentiatie. Vul putjes van een plaat met zes putjes vooraf met drie milliliter stadium twee medium, waaraan twee millimolair ultraglutamine, 55 micromolair bèta-mercaptoethanol, 25 nanogram per milliliter, humaan interleukine-3 en 100 nanogram per milliliter menselijke macrofaagkoloniestimulerende factor wordt toegevoegd.

Gebruik een P-1000 en een tip met brede boring om acht EB's over te brengen in elk putje van de plaat met zes putjes. Controleer na het overbrengen met het oog onder de stereomicroscoop of er acht EB's in elk putje zitten. Na vijf tot zeven dagen zou een drijvende celpopulatie bestaande uit hematopoëtische cellen zichtbaar moeten worden.

De hematopoëtische differentiatieperiode kan worden gevarieerd, te beginnen met zeven dagen. Differentiatie gedurende 10 dagen toonde een hematopoëtische populatie bestaande uit grote CD45+CD14+en CD11b+subpopulaties. Voer na vijf dagen behandeling met medium in fase twee een mediumwissel uit door het oude medium voorzichtig te verwijderen en in een conische buis van 50 milliliter te doseren.

Voeg onmiddellijk een milliliter nieuw stadium twee medium toe aan de putjes. Om eventueel al aanwezige drijvende hematopoëtische cellen te sparen, draait u de buis met het oude medium gedurende vijf minuten rond bij 300 G. Voeg nieuw medium van fase twee toe aan de buis en resuspendeer om cellen los te maken die mogelijk met het oude medium zijn overgedragen.

Voeg twee milliliter nieuw stadium twee medium met opgeslagen cellen toe aan elk putje, dat voorheen gevuld was met één milliliter stadium twee medium. Op dag 10 van de hematopoëtische differentiatie worden drijvende hematopoëtische cellen geoogst door ze te verzamelen in een conische buis van 50 milliliter en kunnen ze ofwel worden ingevroren met behulp van 10% DMSO, 50% FBS en 40% medium, of onmiddellijk worden gebruikt om cellen verder te differentiëren tot osteoclasten. M-CSF-rijping en osteoclastdifferentiatie.

Zaadcellen met 200.000 cellen per vierkante centimeter en gedurende drie dagen behandelen met alfa MEM aangevuld met 10% FBS en 50 nanogram per milliliter M-CSF. Om functionele assays of beeldvorming uit te voeren, maakt u de MCSF-gerijpte cellen los door ze te wassen met een P-1000 met brede diameter. Breng losgemaakte cellen met oud medium over in een buis en draai ze gedurende vijf minuten rond bij 300 G.

Resuspendeer en los de celpellet op met verse alfa-MEM aangevuld met 10% FBS, 50 nanogram per milliliter M-CSF en 80 nanogram per milliliter RANK-ligand. Zaai de cellen opnieuw in met 200.000 cellen per vierkante centimeter en differentieer gedurende zeven tot negen dagen. Meerkernige osteoclasten verschijnen meestal rond dag vijf tot zeven.

Representatieve resultaten. De samenstelling van de gegenereerde hematopoëtische celpopulatie kan worden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. Hier vertonen hematopoëtische cellen een grote populatie CD45+-voorlopercellen.

Celpopulaties die de monocytmarkers CD14 en CD11b tot expressie brengen, vormen meestal een derde van de gehele populatie in vergelijking met isotypecontroles. Terminaal gedifferentieerde IPSC-afgeleide osteoclasten kunnen onder de microscoop worden bekeken als TRAP-positieve meerkernige cellen. Confocale microscopie toont celkleuring voor cathepsine K. Functionele assays zoals bot- of mineraalabsorptieassays maken verdere kwantificering van osteoclastactiviteit mogelijk.

Hier zijn resorptieputten zichtbaar na het verwijderen van rijpe osteoclasten met 10% bleekmiddel voorafgaand aan beeldvorming, terwijl M-CSF-gerijpte osteoclastprecursoren die zijn behandeld zonder toevoeging van RANK-ligand geen resorptieputten vertonen. Conclusie. Dit protocol maakt de robuuste en betrouwbare differentiatie van menselijke osteoclasten mogelijk en zou een kant-en-klare oplossing kunnen bieden voor botziekten of ziekten waarbij sprake is van overmatige verkalking. We gebruiken osteoclasten om ze verder te ontwikkelen in onze RANK-cellen die een intracellulair signaaldomein gebruiken dat kan worden geactiveerd in combinatie met een chemische inductor van dimerisatie voor gecontroleerde en osteoprotegerine-onafhankelijke osteoclastactivering.