Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

Biomolecuulinteracties, waaronder eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties, zijn essentieel in biochemisch onderzoek. In deze studie gebruiken we biolaaginterferometrie, of BLI, een efficiënte techniek om deze interacties te analyseren. We richten ons op replicatie-eiwit A en de bindingsaffiniteit ervan voor een enkelstrengs DNA om de principes en mogelijkheden van BLI te demonstreren.

Biolaaginterferometrie is een gemakkelijke en kosteneffectieve methode om de eiwitkinetiek te bestuderen. Het maakt snelle real-time monitoring van eiwitinteracties mogelijk en biedt een eenvoudige workflow met minder complexiteit dan andere technieken. In ons labo bestuderen we de impact van posttranslationele modificaties op de structuur en functie van de eiwitten die essentieel zijn voor het behoud van genoomstabiliteit.

Deze wijzigingen kunnen trapsgewijze effecten initiëren over replicatie- en reparatieroutes. Door eiwitinteracties te bestuderen, willen we de onderliggende mechanismen blootleggen die de integriteit van het genoom beschermen. Bereid om te beginnen 12,5 nanomolaar voor van drie eersteklas bio enkelstrengs poly dT 32 aassubstraat en vier concentraties RPA met behulp van BLI-buffer.

Voeg met behulp van een pipet 250 microliter BLI-buffer toe aan twee microfugebuisjes van 0,5 milliliter en label ze als AND. Pipetteer in een aparte plaat met 96 putjes 200 microliter BLI-buffer in één putje. Plaats de bak met biosensoren op de plaat met 96 putjes zodat één biosensor in de BLI-buffer duikt.

Klik in de software op de hydraatoptie en stel de timer in op 10 minuten. Pas de uitvoeringsinstellingen aan voor elke stap, basislijn, associatie en dissociatie. Druk op uitvoeren op de software en volg de instructies in het promptbericht.

Plaats twee bays in de buishouder en bevestig de gehydrateerde biosensor aan het BLI-systeem. Schuif de slanghouder onder de biosensor op positie A en bewaak de basislijn voor de biosensor. Nadat u de eerste basislijn hebt voltooid, opent u het deksel en voegt u vier microliter BLI-buffer toe aan de druppelhouder.

Schuif de druppelhouder naar rechts onder dezelfde biosensor op positie B.Zodra het deksel is gesloten, controleert u de BLI-curve op de software. Open vervolgens het deksel en vervang buis A door buis D.Schuif de nieuwe buis onder de biosensor op positie A voordat u het deksel sluit en analyseer de dissociatiestap in de interface. Plaats buis A in de buishouder.

Bevestig de gehydrateerde biosensor aan het BLI-systeem en schuif de slanghouder onder de biosensor zoals eerder weergegeven. Klik vervolgens op uitvoeren op de software-interface voor basisinstellingen. Nadat u vier microliter 12,5 nanomolair enkelstrengs DNA-aas aan de druppelhouder hebt toegevoegd en onder de biosensor hebt geschoven voor de associatiestap, controleert u de BLI-curve op de software.

Open vervolgens het deksel om buis A te vervangen door D.Schuif deze onder de biosensor en ga verder met de dissociatiestap. Zodra de dissociatiestap is voltooid, opent u het deksel en maakt u de biosensor los. Plaats vervolgens de biosensor in de bak met BLI-buffer.

Voeg met behulp van een pipet 250 microliter BLI-buffer toe aan 10 zwarte microfugebuisjes van 0,5 milliliter. Label de buizen als A1 tot A5 en D1 tot D5. Vul de experimentele gegevens in op de software-interface en druk op de berekeningsknop om de informatie te verwerken. In een aparte plaat met 96 putjes pipetteer 200 microliter stripbuffer in het putje dat overeenkomt met de positie van de gehydrateerde biosensor.

Nadat je tube A1 in de buishouder hebt geplaatst, de bait coated biosensor aan het BLI systeem hebt bevestigd en de tube onder de biosensor hebt geschoven, druk je op run op de software. Zodra de eerste basisstap is voltooid, opent u het deksel en voegt u vier microliter BLI-buffer toe aan de druppelhouder. Schuif de druppelhouder onder de biosensor en bewaak de koppelingsstap op de BLI-interface.

Vervang buis A1 door D1. Schuif deze onder de biosensor en sluit het deksel. Bewaak vervolgens de dissociatiestap op de BLI-interface. Zodra de dissociatiestap is voltooid, opent u het deksel, verwijdert u de biosensor en plaatst u deze terug in de bak met BLI-buffer.

Bevestig vervolgens de bait-coated biosensor en plaats tube A2 in de tubehouder. Schuif het buisje onder de biosensor en klik op de software uitvoeren. Voeg na de basisstap vier microliter RPA van vijf nanomolaire RPA toe aan de druppelhouder.

Schuif de druppelhouder onder de biosensor en sluit de deksel. Bewaak de associatiecurve op de software-interface. Verwijder de biosensor en dompel deze 30 seconden in de stripbuffer.

Dompel de biosensor vervolgens gedurende drie minuten in de BLI-buffer. Vink in de tabel met het label Lijst uitvoeren het vakje aan voor de analytconcentratie van nul nanomolair om als referentiecurve te dienen, vink het vakje aan, analyseer, voor alle concentraties van de analyt. Selecteer zowel het begin van de associatie als het begin van de dissociatie voor stapcorrectie, kies globale aanpassing voor de test.

Klik vervolgens op analyseren om de gegevens te verwerken. Om de aangepaste gegevens te exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de grafiek die is gegenereerd op basis van de analysegegevens. Selecteer gegevens exporteren, kies vervolgens tekst of gegevens, klik op bestand en blader vervolgens om de gegevens in het DAT-formaat op te slaan.

Open de software en selecteer geavanceerde kinetiek in het linkerdeelvenster. Nadat u een plaat met 96 putjes in de biosensorbak hebt geplaatst en 200 microliter BLI-buffer aan vijf putjes hebt toegevoegd, plaatst u de biosensorbak in de plaat om de sensoren te hydrateren. Terwijl de biosensoren hydrateren, pipetteer je 250 microliter BLI-buffer in 10 zwarte centrifugebuisjes van 0,5 milliliter.

Vul de experimentele gegevens in op de software-interface en druk op de berekeningsknop om de informatie te verwerken. Nadat u de buishouder met buis A1 onder de biosensor hebt geschoven, klikt u op rennen om de eerste basislijn te verkrijgen. Voeg vier microliter van de BLI-buffer toe aan de druppelhouder.

Schuif de druppelhouder onder de biosensor, sluit het deksel en bewaak de curve voor het laden in de software. De spectrale verschuiving tijdens RPA-binding met behulp van basiskinetiek toonde een dosisafhankelijke toename van de bindingssterkte aan met verzadiging bereikt bij 40 nanomolair. De spectrale verschuiving tijdens RPA-binding met behulp van geavanceerde kinetiek vertoonde op dezelfde manier dosisafhankelijke binding, maar met individuele biosensoren die per concentratie werden gebruikt voor verbeterde nauwkeurigheid.