Name: Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Leer een geoptimaliseerde TEM-voorbereidingsmethode voor retinale organoïden om synaptische ultrastructuur op nanoschaal te analyseren. Dit protocol biedt reproduceerbare stappen voor subcellulair onderzoek in de neurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Geoptimaliseerd protocol voor de voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor TEM

<ol><li>Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+pluripotent+stem+cells+to+model+and+treat+inherited+degenerative+diseases+of+the+outer+retina%3A+3d-organoids+limitations+and+bioengineering+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions.</a> Cells. 10 (9), 2489(2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribbon+synapses+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Ribbon synapses of the retina.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Webvision%3A+The+organization+of+the+retina+and+visual%22">Webvision: The organization of the retina and visual</a>. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).</li>
<li>Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maintenance+and+restoration+in+the+retina+by+ngl2%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2.</a> Elife. 7, e30388(2018).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746 (2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
<li>Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-chip+for+therapy+development+and+fundamental+science%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human-on-chip for therapy development and fundamental science.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).</li>
<li>Chahine Karam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ipsc-derived+retinal+organoids+and+retinal+pigment+epithelium+for+novel+intronic+rpgr+variant+assessment+for+therapy+suitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability.</a> J Pers Med. 12 (3), 502(2022).</li>
<li>Lo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+for+glaucoma+and+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies.</a> Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3d+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), 171686(2019).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).</li>
<li>Cora, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cleared+view+on+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">A cleared view on retinal organoids.</a> Cells. 8 (5), 391(2019).</li>
<li>Żak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy%E2%94%80development%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives.</a> Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).</li>
<li>Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+foveola+reinvestigated%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the foveola reinvestigated.</a> PeerJ. 6, e4482(2018).</li>
<li>Syrbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cells+of+the+primate+foveola%3A+An+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study.</a> Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+receive+cone+photoreceptor+inputs+through+both+invaginating+synapses+and+flat+contacts+in+the+mouse+and+guinea+pig+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas.</a> J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+rpgra+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%CE%B1-synuclein+in+the+mouse+retina+is+confined+to+inhibitory+presynaptic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements.</a> J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+degeneration+of+photoreceptor+synapse+in+ccl2%2Fcx3cr1-deficient+mice+on+crb1%28rd8%29+background%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background.</a> Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).</li>
<li>De Robertis, E., Franchi, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+on+synaptic+vesicles+in+synapses+of+the+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones.</a> J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).</li>
<li>Frey, T. G., Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+structure+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The internal structure of mitochondria.</a> Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+retinal+organoids+recapitulate+disease+features+of+late-onset+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).</li>
<li>Afanasyeva, T. aV., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+into+retinal+organoids%3A+Methods%2C+analytical+techniques%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mm Petri schaal</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Cel lifter</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-395251</td><td></td></tr><tr><td>Koperroosters</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td>AZH400HH</td><td></td></tr><tr><td>DigitalMicrograph Software</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>#07913</td><td>Bacterieel protease</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Gibco</td><td>#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingsmal</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td>GZ10592</td><td></td></tr><tr><td>Epon-812 hars</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>#14900</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>#04-0021A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Shownin Biotechnology Co. Ltd.</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>Loodcitraat</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td>GZ02618</td><td></td></tr><tr><td>L-GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050061</td><td>L-glutamine substituut</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Een component van PB/PBS</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Een component van PB/PBS</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Sigma</td><td>#M7145</td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop</td><td>Lab Binoculaire Biologische Microscoop</td><td>Xsz-107bnii</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Bluepard</td><td>BPG9040A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Semi/ultradunne microtoom</td><td>Reichert-Jung</td><td>396649</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>#T0625</td><td></td></tr><tr><td>Toluidineblauw</td><td>Sangon Biotech</td><td>E670105-0100</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscopen</td><td>HITACHI</td><td>H-7500</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetaat</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

preparing-retinal-organoid-samples-for-transmission-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De niet-menselijke primaat is een belangrijk translationeel soort voor ons begrip van de ontwikkeling en veroudering. De anatomische organisatie van het primaat netvlies kan leveren belangrijke inzichten in normale en pathologische omstandigheden bij de mens.

De poort naar de hersenen: Ontrafeling van de Primate Eye

Deze video artikel demonstreert de oprichting van organotypische netvlies wholemount culturen en een Cytospin procedure voor de analyse van exogeen geïnduceerde effecten. Organotypische netvlies wholemount culturen na te bootsen van...

In vivo-achtige organotypische Murine netvlies Wholemount Cultuur

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol om volwassen menselijke retinale organoïden te genereren en deze te gebruiken in een fotoreceptortoxiciteitstest om farmaceutische kandidaten te identificeren voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte maculaire teleangiëctasieën type 2 (MacTel).

Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC's in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.

Generatie van retinale organoïden uit gezonde en retinale ziekte-specifieke door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie, met de nadruk op de structurele kenmerken van retinale fotoreceptorterminals.

Voorbereiding van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie

Dit protocol combineert optische klaring en immunolabeling voor confocale beeldvorming van het hele netvlies van de hele montuur. Het behoudt de 3D-structuur, waardoor gedetailleerde visualisatie van belangrijke neuronale paden mogelijk is, waardoor de studie van retinale rijping, ruimtelijke organisatie en de mogelijke toepassingen ervan in ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde worden verbeterd.

Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Leer een geoptimaliseerde TEM-voorbereidingsmethode voor retinale organoïden om synaptische ultrastructuur op nanoschaal te analyseren. Dit protocol biedt reproduceerbare stappen voor subcellulair onderzoek in de neurobiologie.

Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen