Name: Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren en kweken van primaire humane mammaire epitheelcellen (HMECs) uit beperkt weefsel. Dit protocol versnelt onderzoek naar granulomateuze mastitis en verbetert klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het TCM Science and Technology Program van de provincie Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), en het Wetenschaps- en Technologieproject van Zunyi, provincie Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) nr. 18) aan X. Xu. De auteurs bedanken het Molecular Biology Laboratory van Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company voor het geven van celcultuurtraining.

Verse, normale borstweefsels die in dit protocol worden gebruikt, worden verzameld bij operaties rond de laesie van refractaire granulomateuze lobulaire mastitis in het First Affiliated Hospital van de Chinese Medical University van Zhejiang volgens de richtlijnen van de Medical Ethics Committee van het First Affiliated Hospital van de Zhejiang Chinese Medical University (Protocol nr. ChiMCTR2100005281, Datum: 2017-07-17).
1. Verwerving van weefsel
<ol><li>Verzamel vers borstweefsel van chirurgische monsters van volwassen vrouwen in steriele buisjes met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 3% penicilline/streptomycine (P/S). OPMERKING: Borstweefsel moet binnen 24 uur na afname van de operatie worden behandeld volgens de volgende details.</li>
</ol>2. Voorbehandeling van weefsel
<ol><li>Verwijder het vetweefsel uit het borstweefsel met twee tangen en zorg ervoor dat het resterende borstweefsel ~1 g weegt.</li>
	<li>Spoel het borstweefsel gedurende 5 s in een 75% ethanoloplossing (5 ml) en was vervolgens met 20 ml wasoplossing (tabel 1) gedurende 2 x 5 minuten.</li>
</ol>3. Vertering van weefsel
<ol><li>Snijd het borstweefsel in kleinere fragmenten en versnipper het weefsel met behulp van twee chirurgische messen gedurende 15 minuten om het weefselhomogenaat te verkrijgen. Breng de weefselstukjes over in een centrifugebuisje van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 10 ml 5,0 mg/ml dispase + 5,0 mg/ml collagenase-oplossing, 3 ml 0,25% trypsine en 7 ml PBS toe aan een totaal van 20 ml spijsverteringsoplossing in een centrifugebuis van 50 ml die de borstweefselfragmenten bevat. Plaats de tube in een waterbad bij 37 °C en incubeer gedurende 1,5 uur; Schud de tube elke 20 minuten.</li>
	<li>Stop het verteringsproces door 20 ml van de neutraliserende oplossing te injecteren. Meng de inhoud door ~15x te pipetteren.</li>
	<li>Filtreer het mengsel door een gaasfilter van 100 μm. Centrifugeer bij 156 × g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en herhaal de incubatie van de pellet met 20 ml neutraliserende oplossing. Meng de inhoud door 15x te pipetteren en centrifugeer op 156 × g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer de celpellet met 10 ml initieel kweekmedium. Leg de celsuspensie in een celkweekschaaltje van 100 mm.</li>
	<li>Kweek de cellen in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C. Vervang het oorspronkelijke kweekmedium om de drie dagen door vers epitheelcelmedium. Controleer de cellen en ververs het medium elke 2 dagen.</li>
</ol>4. Cel passeren
<ol><li>Haal de schaal van 100 mm uit de incubator wanneer de cellen 80%-90% samenvloeien, gooi het gebruikte medium weg en spoel de schaal 2x met 2 ml PBS. Verwijder PBS en voeg vervolgens 2 ml 0,05% trypsine toe aan elk schaaltje van 100 mm. NOTITIE: Draai de schaal rond om er zeker van te zijn dat de trypsine-oplossing voldoende contact heeft met de bodem van de schaal.</li>
	<li>Plaats de schaal van 100 mm in een incubator van 37 °C gedurende ~7 min voor het verteringsproces.</li>
	<li>Onderzoek de cellen met een microscoop met behulp van een 40x objectief om er zeker van te zijn dat de meeste cellen zijn losgekoppeld van de bodem van de schaal.</li>
	<li>Stop het verteringsproces door 8 ml neutraliserende oplossing toe te voegen en de cellen over te brengen naar een buisje van 15 ml. Meng de cellen door 10-15x op en neer te pipetteren. Centrifugeer de cellen bij 156 × g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig, resuspendeer de cellen met 10 ml epitheelcelmedium en tel het aantal cellen.</li>
	<li>Voeg 1 × 10,6 cellen in 10 ml epitheelcelmedium toe in een schaaltje van 100 mm.</li>
	<li>Ververs het epitheelcelmedium en observeer de cellen elke 2 dagen.</li>
</ol>5. Cryopreservatie van cellen
<ol><li>Herhaal stap 4.1-4.4.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer de cellen in 2 ml cryopreservatieoplossing voor cellen.</li>
	<li>Breng 1 ml van de cryopreservatieoplossing met de cellen over in elke cryogene injectieflacon.</li>
	<li>Noteer de namen van de ingevroren cellen, de doorgangsnummers en de datums.</li>
	<li>Plaats de injectieflacons een nacht in een diepvriescontainer met gecontroleerde snelheid bij -80 °C.</li>
	<li>Haal de cryogene injectieflacons uit de vriezer van -80 °C en breng ze snel over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.</li>
</ol>

Protocol voor het isoleren van borstepitheelcellen uit menselijk weefsel

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
<li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li>
<li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li>
<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

HMEC's zijn van vitaal belang voor het behoud van de anatomische en functionele integriteit van borstweefsel en ze zijn nuttig bij wetenschappelijk onderzoek, klinische implementaties en aanverwante domeinen15. Primaire epitheelcellen zijn een soort gespecialiseerde cellen met beperkte doorgangen en een kortere levensduur. De groei van HMEC's wordt echter belemmerd door technische beperkingen, die bijgevolg de vooruitgang in het onderzoek naar borstkanker en andere ontstekingsziekten die verband h...

Borstkanker is de primaire vorm van kanker die wereldwijd bij vrouwen wordt gediagnosticeerd en is de belangrijkste doodsoorzaak door kanker. De pathogenese van borstkanker is complex en omvat meerdere factoren, zoals genetica, omgeving en levensstijl. HMEC's, actieve melkproducerende cellen, zijn een van de belangrijkste componenten van borstweefsel en zijn waarschijnlijk de oorspronkelijke cellen die betrokken zijn bij carcinogenese van borstkanker. Daarom hebben HMEC's de meeste aandacht gekregen van onderzoekers voor de studie van borstkanker2. Bovendien hebben primaire cellen het vermogen om een biologisch relevante karakterisering van complexe cellulaire processen te bieden vanwege hun behoud van genetische stabiliteit, normale morfologie en een completere set van cellulaire basisfuncties die niet kunnen worden bereikt met onsterfelijke cellijnen3. Daarom is de isolatie en kweek van primaire HMEC's een essentiële stap voor de studie van de meeste borstgerelateerde ziekten zoals borstkanker en borstontstekingsziekten.
Op dit moment is er een stabiel en reproduceerbaar systeem opgezet voor de isolatie, kweek en identificatie van borstepitheelcellen van ratten, koeien, varkens en geiten 4,5,6,7. De isolatie en kweek van primaire HMEC's zijn echter een uitdaging vanwege de complexe micro-omgeving en de lage opbrengst van cellen. Decennialang zijn wetenschappers op zoek geweest naar de meest effectieve methode om HMEC's te isoleren en te cultiveren, hoewel er bijna 20 jaar geleden een kweeksysteem voor HMEC's werd opgezet. Zo ontwikkelden Hammond et al. een serumvrij kweekmedium waarin HMEC's efficiënt groeiden8. Onlangs hebben Zubeldia-Plazaola et al. vier verschillende isolatiemethoden getest met behulp van snelle/langzame enzymverteringsprocedures in combinatie met sequentiële filtratie of differentiële centrifugatiestappen om HMEC's9 te verkrijgen. Ze ontdekten dat de langzame verteringsmethode samen met differentiële centrifugatie de meest efficiënte methode is om HMEC's te isoleren uit vers borstweefsel. Die isolatiemethode vereist echter grote stukken weefsel (40-75 g) en maakt gebruik van grotere hoeveelheden spijsverteringsenzymen. Hun procedure is ingewikkeld (minstens drie verschillende centrifugaties om verschillende celfracties te verkrijgen) en ook tijdrovend. Daarom is er nog steeds een eenvoudige en snelle methode nodig om efficiënt populaties HMEC's te verkrijgen uit kleine hoeveelheden borstweefsel voor onderzoek en klinische toepassingen9.
Onze eerdere studies toonden aan dat het toevoegen van de Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer Y-27632 aan het oorspronkelijke kweekmedium het proces van het isoleren van epidermale cellen van de menselijke huid10 kan vereenvoudigen, wat ook met succes is gebruikt voor de isolatie van gingivale epitheelcellen11. Bovendien heeft eerder onderzoek uitgevoerd door de groep van Zubeldia-Plazaola en de groep van Jin aangetoond dat Y-27632 het vermogen heeft om een snelle en onbeperkte in vitro groei van primaire epitheelcellen afkomstig van borstweefsel te stimuleren 9,12. De huidige studie was bedoeld om te testen of het gebruik van Y-27632 de isolatie en kweek van HMEC's zou vereenvoudigen en we hebben met succes een eenvoudige en gemakkelijk uit te voeren methode ontwikkeld om HMEC's te isoleren uit kleine stukjes (1 g) borstweefsel.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>Voor HMECs&nbsp; dissociatie</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>Voor celdigestie</td></tr><tr><td>100 µm mesh filter</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>Voor HMECs filtratie</td></tr><tr><td>100 mm Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>solarbio</td><td>P1110-100ml</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HMECs te controleren</td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Voor celcentrifugatie</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>Celfiltratie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>Celcentrifuge</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>Voor celincubatie</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>Voor HMECs isolatie</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS:42613-33-2</td><td>Voor HMECs isolatie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>Onderdeel van neutralisatiemedium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>Onderdeel van neutralisatiemedium</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde oplossing</td><td>Tecono</td><td>20201033</td><td>Wasoplossing</td></tr><tr><td>konijn anti CK7</td><td>abcam</td><td>ab68459</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HMECs te controleren</td></tr><tr><td>konijn anti GATA3</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HMECs te controleren</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>ROCK remmer</td></tr></tbody></table>

isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

De borstklier is een fundamentele structuur van de borst en speelt een essentiële rol bij de voortplanting. Menselijke borstepitheelcellen (HMEC's), de oorsprongscellen van borstkanker en andere borstgerelateerde ontstekingsziekten, hebben veel aandacht gekregen. Het isoleren en kweken van primaire HMEC's in vitro voor onderzoeksdoeleinden was echter een uitdaging vanwege hun sterk gedifferentieerde, verhoornde aard en hun korte levensduur. Daarom is het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte methode om HMEC's te isoleren en te kweken van grote wetenschappelijke waarde voor de studie van borstbiologie en borstgerelateerde ziekten. In deze studie hebben we met succes primaire HMEC's geïsoleerd uit kleine hoeveelheden borstweefsel door vertering met een mengsel van enzymen in combinatie met een initiële cultuur in 5% foetaal runderserum-DMEM met de Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer Y-27632, gevolgd door kweekexpansie in serumvrij keratinocytmedium. Deze aanpak bevordert selectief de groei van epitheelcellen, wat resulteert in een geoptimaliseerde celopbrengst. De eenvoud en het gemak van deze methode maken het geschikt voor zowel laboratorium- als klinisch onderzoek, wat waardevolle inzichten zou moeten opleveren in deze belangrijke onderzoeksgebieden.

Figuur 1 toont een schema van de procedure. Het protocol omvat het gebruik van een combinatie van enzymen, namelijk dispase, collagenase en trypsine. Deze combinatie wordt gebruikt om het epitheelblad los te maken van de fibroblastlaag eronder en vervolgens trypsine te gebruiken om de borstepitheelcellen te dissociëren tot een suspensie. Bovendien werd de groei van epitheelcellen effectief bevorderd door Y-27632 toe te voegen aan het oorspronkelijke kweekmedium. Hierdoor levert deze methode ...

De huidige studie rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol om primaire menselijke borstepitheelcellen (HMEC's) efficiënt te isoleren en te laten groeien uit kleine hoeveelheden borstweefsel. Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's, zowel voor laboratorium- als klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Ons onderzoek richt zich op het ophelderen van de behandelingsmogelijkheden voor refractaire granulomateuze mastitis. Door gebruik te maken van een integratieve benadering die traditionele Chinese en westerse medische methodologieën tegelijkertijd combineert, zullen de complexe pathogene mechanismen die de ziekte en de complicaties ervan veroorzaken, blootleggen, met een focus op het verlichten van deze problemen en het verbeteren van de prognose van de patiënt. Ons onderzoek rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol voor het efficiënt isoleren en kweken van primaire menselijke borstepitheelcellen, of HMEC's, uit een kleine hoeveelheid borstweefsel.Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's voor laboratorium- en klinische toepassingen. Voortbouwend op deze studie willen we een granulomateuze mastitis borstepitheelcelmodel ontwikkelen om ons begrip van etiologie en gevalideerde behandelingsstrategieën te verdiepen.

isolation-and-culture-of-primary-human-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's), rijk aan myofibroblasten aanwezig in de tumor stroma, spelen een belangrijke rol in het besturen van tumorprogressie. We ontwikkelden een coimplantation tumor xengraft model voor het genereren van experimenteel CAFS uit humane fibroblasten borstklieren. Het protocol beschrijft hoe om vast te stellen CAF myofibroblasten dat het vermogen om tumorgenese bevorderen verwerven.

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

We beschrijven een 3D-kweekmodel van het menselijk borstpijtheel dat geschikt is om hormoonwerking te bestuderen.

Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Leer een efficiënte methode voor het isoleren en kweken van primaire humane mammaire epitheelcellen (HMECs) uit beperkt weefsel. Dit protocol versnelt onderzoek naar granulomateuze mastitis en verbetert klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Meer video's verkennen