Name: Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren en kweken van primaire humane mammaire epitheelcellen (HMECs) uit beperkt weefsel. Dit protocol versnelt onderzoek naar granulomateuze mastitis en verbetert klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het TCM Science and Technology Program van de provincie Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), en het Wetenschaps- en Technologieproject van Zunyi, provincie Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) nr. 18) aan X. Xu. De auteurs bedanken het Molecular Biology Laboratory van Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company voor het geven van celcultuurtraining.

Verse, normale borstweefsels die in dit protocol worden gebruikt, worden verzameld bij operaties rond de laesie van refractaire granulomateuze lobulaire mastitis in het First Affiliated Hospital van de Chinese Medical University van Zhejiang volgens de richtlijnen van de Medical Ethics Committee van het First Affiliated Hospital van de Zhejiang Chinese Medical University (Protocol nr. ChiMCTR2100005281, Datum: 2017-07-17).
1. Verwerving van weefsel
<ol><li>Verzamel vers borstweefsel van chirurgische monsters van volwassen vrouwen in steriele buisjes met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 3% penicilline/streptomycine (P/S). OPMERKING: Borstweefsel moet binnen 24 uur na afname van de operatie worden behandeld volgens de volgende details.</li>
</ol>2. Voorbehandeling van weefsel
<ol><li>Verwijder het vetweefsel uit het borstweefsel met twee tangen en zorg ervoor dat het resterende borstweefsel ~1 g weegt.</li>
	<li>Spoel het borstweefsel gedurende 5 s in een 75% ethanoloplossing (5 ml) en was vervolgens met 20 ml wasoplossing (tabel 1) gedurende 2 x 5 minuten.</li>
</ol>3. Vertering van weefsel
<ol><li>Snijd het borstweefsel in kleinere fragmenten en versnipper het weefsel met behulp van twee chirurgische messen gedurende 15 minuten om het weefselhomogenaat te verkrijgen. Breng de weefselstukjes over in een centrifugebuisje van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 10 ml 5,0 mg/ml dispase + 5,0 mg/ml collagenase-oplossing, 3 ml 0,25% trypsine en 7 ml PBS toe aan een totaal van 20 ml spijsverteringsoplossing in een centrifugebuis van 50 ml die de borstweefselfragmenten bevat. Plaats de tube in een waterbad bij 37 °C en incubeer gedurende 1,5 uur; Schud de tube elke 20 minuten.</li>
	<li>Stop het verteringsproces door 20 ml van de neutraliserende oplossing te injecteren. Meng de inhoud door ~15x te pipetteren.</li>
	<li>Filtreer het mengsel door een gaasfilter van 100 μm. Centrifugeer bij 156 × g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en herhaal de incubatie van de pellet met 20 ml neutraliserende oplossing. Meng de inhoud door 15x te pipetteren en centrifugeer op 156 × g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer de celpellet met 10 ml initieel kweekmedium. Leg de celsuspensie in een celkweekschaaltje van 100 mm.</li>
	<li>Kweek de cellen in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C. Vervang het oorspronkelijke kweekmedium om de drie dagen door vers epitheelcelmedium. Controleer de cellen en ververs het medium elke 2 dagen.</li>
</ol>4. Cel passeren
<ol><li>Haal de schaal van 100 mm uit de incubator wanneer de cellen 80%-90% samenvloeien, gooi het gebruikte medium weg en spoel de schaal 2x met 2 ml PBS. Verwijder PBS en voeg vervolgens 2 ml 0,05% trypsine toe aan elk schaaltje van 100 mm. NOTITIE: Draai de schaal rond om er zeker van te zijn dat de trypsine-oplossing voldoende contact heeft met de bodem van de schaal.</li>
	<li>Plaats de schaal van 100 mm in een incubator van 37 °C gedurende ~7 min voor het verteringsproces.</li>
	<li>Onderzoek de cellen met een microscoop met behulp van een 40x objectief om er zeker van te zijn dat de meeste cellen zijn losgekoppeld van de bodem van de schaal.</li>
	<li>Stop het verteringsproces door 8 ml neutraliserende oplossing toe te voegen en de cellen over te brengen naar een buisje van 15 ml. Meng de cellen door 10-15x op en neer te pipetteren. Centrifugeer de cellen bij 156 × g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig, resuspendeer de cellen met 10 ml epitheelcelmedium en tel het aantal cellen.</li>
	<li>Voeg 1 × 10,6 cellen in 10 ml epitheelcelmedium toe in een schaaltje van 100 mm.</li>
	<li>Ververs het epitheelcelmedium en observeer de cellen elke 2 dagen.</li>
</ol>5. Cryopreservatie van cellen
<ol><li>Herhaal stap 4.1-4.4.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer de cellen in 2 ml cryopreservatieoplossing voor cellen.</li>
	<li>Breng 1 ml van de cryopreservatieoplossing met de cellen over in elke cryogene injectieflacon.</li>
	<li>Noteer de namen van de ingevroren cellen, de doorgangsnummers en de datums.</li>
	<li>Plaats de injectieflacons een nacht in een diepvriescontainer met gecontroleerde snelheid bij -80 °C.</li>
	<li>Haal de cryogene injectieflacons uit de vriezer van -80 °C en breng ze snel over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.</li>
</ol>

Protocol voor het isoleren van borstepitheelcellen uit menselijk weefsel

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
<li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li>
<li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li>
<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

HMEC's zijn van vitaal belang voor het behoud van de anatomische en functionele integriteit van borstweefsel en ze zijn nuttig bij wetenschappelijk onderzoek, klinische implementaties en aanverwante domeinen15. Primaire epitheelcellen zijn een soort gespecialiseerde cellen met beperkte doorgangen en een kortere levensduur. De groei van HMEC's wordt echter belemmerd door technische beperkingen, die bijgevolg de vooruitgang in het onderzoek naar borstkanker en andere ontstekingsziekten die verband houden met de borst hebbenbelemmerd16.
Daarom is er dringend behoefte aan een stabiele, haalbare en efficiënte methode om HMEC's te verkrijgen uit vers borstweefsel. Hammond et al.8 en Band en Sager17 hebben met succes borstepitheelcellen geëxtraheerd en gekweekt. De samenstelling van het benodigde kweekmedium was echter te complex. Eerdere studies van Taylor-Papidamitriou et al. toonden aan dat holtecellen uit moedermelk gekweekt konden worden met behulp van een medium aangevuld met groeifactoren en serum18. Hoewel hun methode de directe extractie van HMEC's uit moedermelk mogelijk maakt, kan de aanwezigheid van niet-epitheelcellen de groei van HMEC's beïnvloeden, waardoor het een uitdaging wordt om het aantal cellen nauwkeurig te bepalen. Jin et al. ontwikkelden een voorwaardelijke herprogrammeringsmethode die ervoor zorgde dat primaire HMEC's een langere levenscyclus hadden en celheterogeniteit behielden in vergelijking met traditionele kweekmethoden, maar het was sterk afhankelijk van specifieke kweekomstandigheden en beperkte het gebruik van deze methode in andere laboratoria en toepassingen12.
Een studie van de groep van Zubeldia-Plazaola stelde een geoptimaliseerde isolatiemethode vast die de langzame vertering ('s nachts) van gehakte weefselfragmenten omvatte door een mengsel van collagenase en hyaluronidase, gevolgd door drie differentiële centrifugaties op de tweede dag om stromale / epitheelfracties te scheiden. Die isolatiemethode plus de toevoeging van Y-27632 aan de kweek leverde hoge aantallen levensvatbare epitheelcellen op. De hoeveelheid borstweefsel die in hun onderzoek werd gebruikt, was echter 40-75 g en de isolatieprocedure duurde bijna 2 dagen9. Hier rapporteren we het gebruik van slechts 1 g weefsel in dit protocol, en we hebben getest en ontdekten dat deze methode ook werkte voor slechts 0,25 g weefsel. Het enzymmengsel van collagenase, dispase en trypsine verteerde efficiënt 1 g weefsel in 1,5 uur en de hele procedure duurde ~ 3 uur. De toevoeging van Y-27632 aan het oorspronkelijke kweekmedium kan de aanhechting en proliferatie van epitheelcellen bevorderen, maar ook de groei van stromale cellen remmen. Belangrijk is dat we in deze studie de componenten van het oorspronkelijke medium hebben getest en ontdekten dat 5% FBS in DMEM ter vervanging van het G-medium dat in de vorige publicatie werd gebruikt, voldoende was om de aanhechting en groei van epidermale cellen te bevorderen10.
Na 2 dagen kweek in het oorspronkelijke medium, werden de cellen gekweekt in serumvrij keratinocytenmedium. Het celgroeipatroon voor de initiële cultuur (P0) na inoculatie is weergegeven in figuur 2, die een koloniegroeipatroon laat zien. Deze isolatiemethode levert waarschijnlijk alle soorten epitheelcellen op, inclusief myoepitheelcellen uit borstweefsels, die in de toekomst verder moeten worden gekarakteriseerd. Desalniettemin, door de groei van cellen in aanwezigheid van Y-27632 te vergelijken met de controlegroep zonder Y-27632 toe te voegen aan het oorspronkelijke kweekmedium, konden we zien dat de methode met Y-27632 de celproductie aanzienlijk verbeterde en de efficiëntie van de celcultuur verbeterde (Figuur 2A). Gewoonlijk ~ 9-10 dagen na inoculatie kunnen de epidermale cellen een dichtheid bereiken die geschikt is om te passeren. Daarnaast toonden we ook aan dat de aanwezigheid van Y-27632 de groei van P1 HMEC zou kunnen versterken na het herstellen van P0-cellen die aan het einde van de eerste cultuur waren ingevroren (Figuur 3). In onze handen ontdekten we dat meer dan 90% van de cellen in staat was om te overleven nadat ze waren ontdooid uit bevroren opslag. De cellen hadden een verdubbelingstijd van ongeveer 72 uur en HMEC's waren in staat om een normale groei te behouden tot de 7e passage.
In deze studie brachten de cellen hoge niveaus van borstepitheelcelmarkers CK7 en GATA3 tot expressie, en belangrijker nog, bijna 100% van de cellen in het late stadium van de initiële kweek waren positief voor CK7 en GATA3 (Figuur 4), wat wijst op een hoge zuiverheid van epitheelcellen verkregen met deze methode. Ten slotte vergeleek deze studie de expressieniveaus van CK7 en GATA3 in P0- en P3-cellen, waarbij hoge expressieniveaus in beide werden onthuld, wat suggereert dat passage het fenotype van de cellen niet veranderde (Figuur 5A,B). Bovendien werden, ongeacht de aanwezigheid van Y-27632, CK7 en GATA3 consequent sterk tot expressie gebracht, wat impliceert dat de toevoeging van Y-27632 geen invloed had op het celfenotype (Figuur 5C,D).
De primaire oorzaak voor de verbetering van de celproliferatie door onze aanpak is de opname van Y-27632, waarvan is aangetoond dat het gunstige effecten heeft op de vermenigvuldiging en specialisatie van menselijke epitheelcellen19,20. Chapman et al. ontdekten dat het gebruik van Y-27632 het vermogen van epitheelcellen om zich te vermenigvuldigen aanzienlijk verbeterde en leidde tot de succesvolle onsterfelijkheid van de cellen zonder tekenen van celcrisis21. In onze studie verhoogde Y-27632 de opbrengst van deze epitheelcellen aanzienlijk door hun aanhechting en proliferatie te verbeteren19.
Een belangrijk kenmerk van deze methode is het combineren van dispase en collagenase om epitheelweefsel van bindweefsel te scheiden, terwijl trypsine ook wordt gebruikt om epitheelcellen van epitheelweefsel te dissociëren. Dispase heeft bewezen een snel en efficiënt maar zacht enzym te zijn om de onbeschadigde epidermis van de dermis te scheiden, evenals onbeschadigde lagen epitheelcellen in cultuur van het onderliggende oppervlak, terwijl de levensvatbaarheid van epitheelcellen behoudenblijft. Type I collagenase vergemakkelijkt de isolatie van epitheelcellen en zorgt voor de vitaliteit en integriteit van de cellen24. Een ander belangrijk kenmerk van deze methode is het gebruik van het initiële medium met Y-27632 om de nieuw geïsoleerde HMEC's te kweken. Nadat de cellen zich op de derde dag aan de schaal hebben gehecht, wordt het kweekmedium veranderd in Keratinocyte Serum-Free Medium. Deze aanpak vereenvoudigt de experimentele stappen op opvallende wijze en verlaagt de kosten van het experiment. Als gevolg hiervan hebben we met deze methode zeer bevredigende celaantallen verkregen met slechts een klein volume borstweefsel, wat aangeeft dat een grote hoeveelheid initieel weefsel niet nodig is. Een nadeel van deze benadering is echter dat de aanwezigheid van trypsine de integriteit van epitheelcellen niet voldoende beschermt. Een ander potentieel beperkend aspect van de methode is de mogelijkheid van een kleine (<1%) besmetting van myoepitheelcellen tijdens de eerste kweek9.
Onze methode biedt een gestroomlijnde en efficiënte aanpak voor het isoleren en kweken van primaire HMEC's afkomstig van volwassen borstweefsel. Deze techniek wordt gekenmerkt door zijn eenvoud, zijn tijdbesparende aard en zijn vermogen om fundamentele cellulaire functies te behouden. Deze techniek heeft dan ook duidelijke voordelen en is veelbelovend voor het genereren van een substantiële hoeveelheid epitheelcellen. Verder maakt de methode het mogelijk om HMEC's te isoleren en te kweken van een breed scala aan donoren, geschikt voor zowel laboratoriumonderzoek als klinische toepassingen, waardoor het zeer veelzijdig en breed toepasbaar is.

Borstkanker is de primaire vorm van kanker die wereldwijd bij vrouwen wordt gediagnosticeerd en is de belangrijkste doodsoorzaak door kanker. De pathogenese van borstkanker is complex en omvat meerdere factoren, zoals genetica, omgeving en levensstijl. HMEC's, actieve melkproducerende cellen, zijn een van de belangrijkste componenten van borstweefsel en zijn waarschijnlijk de oorspronkelijke cellen die betrokken zijn bij carcinogenese van borstkanker. Daarom hebben HMEC's de meeste aandacht gekregen van onderzoekers voor de studie van borstkanker2. Bovendien hebben primaire cellen het vermogen om een biologisch relevante karakterisering van complexe cellulaire processen te bieden vanwege hun behoud van genetische stabiliteit, normale morfologie en een completere set van cellulaire basisfuncties die niet kunnen worden bereikt met onsterfelijke cellijnen3. Daarom is de isolatie en kweek van primaire HMEC's een essentiële stap voor de studie van de meeste borstgerelateerde ziekten zoals borstkanker en borstontstekingsziekten.
Op dit moment is er een stabiel en reproduceerbaar systeem opgezet voor de isolatie, kweek en identificatie van borstepitheelcellen van ratten, koeien, varkens en geiten 4,5,6,7. De isolatie en kweek van primaire HMEC's zijn echter een uitdaging vanwege de complexe micro-omgeving en de lage opbrengst van cellen. Decennialang zijn wetenschappers op zoek geweest naar de meest effectieve methode om HMEC's te isoleren en te cultiveren, hoewel er bijna 20 jaar geleden een kweeksysteem voor HMEC's werd opgezet. Zo ontwikkelden Hammond et al. een serumvrij kweekmedium waarin HMEC's efficiënt groeiden8. Onlangs hebben Zubeldia-Plazaola et al. vier verschillende isolatiemethoden getest met behulp van snelle/langzame enzymverteringsprocedures in combinatie met sequentiële filtratie of differentiële centrifugatiestappen om HMEC's9 te verkrijgen. Ze ontdekten dat de langzame verteringsmethode samen met differentiële centrifugatie de meest efficiënte methode is om HMEC's te isoleren uit vers borstweefsel. Die isolatiemethode vereist echter grote stukken weefsel (40-75 g) en maakt gebruik van grotere hoeveelheden spijsverteringsenzymen. Hun procedure is ingewikkeld (minstens drie verschillende centrifugaties om verschillende celfracties te verkrijgen) en ook tijdrovend. Daarom is er nog steeds een eenvoudige en snelle methode nodig om efficiënt populaties HMEC's te verkrijgen uit kleine hoeveelheden borstweefsel voor onderzoek en klinische toepassingen9.
Onze eerdere studies toonden aan dat het toevoegen van de Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer Y-27632 aan het oorspronkelijke kweekmedium het proces van het isoleren van epidermale cellen van de menselijke huid10 kan vereenvoudigen, wat ook met succes is gebruikt voor de isolatie van gingivale epitheelcellen11. Bovendien heeft eerder onderzoek uitgevoerd door de groep van Zubeldia-Plazaola en de groep van Jin aangetoond dat Y-27632 het vermogen heeft om een snelle en onbeperkte in vitro groei van primaire epitheelcellen afkomstig van borstweefsel te stimuleren 9,12. De huidige studie was bedoeld om te testen of het gebruik van Y-27632 de isolatie en kweek van HMEC's zou vereenvoudigen en we hebben met succes een eenvoudige en gemakkelijk uit te voeren methode ontwikkeld om HMEC's te isoleren uit kleine stukjes (1 g) borstweefsel.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>Voor HMECs&nbsp; dissociatie</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>Voor celdigestie</td></tr><tr><td>100 µm mesh filter</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>Voor HMECs filtratie</td></tr><tr><td>100 mm Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>solarbio</td><td>P1110-100ml</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HMECs te controleren</td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Voor celcentrifugatie</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>Celfiltratie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>Celcentrifuge</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>Voor celincubatie</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>Voor HMECs isolatie</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS:42613-33-2</td><td>Voor HMECs isolatie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>Onderdeel van neutralisatiemedium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>Onderdeel van neutralisatiemedium</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde oplossing</td><td>Tecono</td><td>20201033</td><td>Wasoplossing</td></tr><tr><td>konijn anti CK7</td><td>abcam</td><td>ab68459</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HMECs te controleren</td></tr><tr><td>konijn anti GATA3</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HMECs te controleren</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>ROCK remmer</td></tr></tbody></table>

isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

De borstklier is een fundamentele structuur van de borst en speelt een essentiële rol bij de voortplanting. Menselijke borstepitheelcellen (HMEC's), de oorsprongscellen van borstkanker en andere borstgerelateerde ontstekingsziekten, hebben veel aandacht gekregen. Het isoleren en kweken van primaire HMEC's in vitro voor onderzoeksdoeleinden was echter een uitdaging vanwege hun sterk gedifferentieerde, verhoornde aard en hun korte levensduur. Daarom is het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte methode om HMEC's te isoleren en te kweken van grote wetenschappelijke waarde voor de studie van borstbiologie en borstgerelateerde ziekten. In deze studie hebben we met succes primaire HMEC's geïsoleerd uit kleine hoeveelheden borstweefsel door vertering met een mengsel van enzymen in combinatie met een initiële cultuur in 5% foetaal runderserum-DMEM met de Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer Y-27632, gevolgd door kweekexpansie in serumvrij keratinocytmedium. Deze aanpak bevordert selectief de groei van epitheelcellen, wat resulteert in een geoptimaliseerde celopbrengst. De eenvoud en het gemak van deze methode maken het geschikt voor zowel laboratorium- als klinisch onderzoek, wat waardevolle inzichten zou moeten opleveren in deze belangrijke onderzoeksgebieden.

Figuur 1 toont een schema van de procedure. Het protocol omvat het gebruik van een combinatie van enzymen, namelijk dispase, collagenase en trypsine. Deze combinatie wordt gebruikt om het epitheelblad los te maken van de fibroblastlaag eronder en vervolgens trypsine te gebruiken om de borstepitheelcellen te dissociëren tot een suspensie. Bovendien werd de groei van epitheelcellen effectief bevorderd door Y-27632 toe te voegen aan het oorspronkelijke kweekmedium. Hierdoor levert deze methode een groot aantal HMEC's op, die in gemiddeld slechts 10 dagen voldoen aan de eisen voor passaging.
Om de cruciale rol van Y-27632 in celgroei na isolatie te testen, verdeelden we vers geïsoleerde cellen in twee groepen: de ene groep werd bekleed met het initiële medium dat 10 mM Y-27632 bevatte (Figuur 2A); de andere groep werd geplateerd met het oorspronkelijke medium zonder Y-27632 als controlegroep toe te voegen (Figuur 2B). Na 2 dagen kweek werden de cellen van beide groepen overgeschakeld op epidermaal celmedium (Figuur 1). Uit figuur 2 kunnen we zien dat in vergelijking met de derde dag, de methode met Y-27632 het aantal HMEC's op de negende dag merkbaar verhoogde. De HMEC's vormden een samenhangende groep die leek op een eiland met duidelijke grenzen en sterke verbindingen tussen cellen. Deze cellen breidden zich uit naar de omgeving. De cellen met Y-27632 (Figuur 2A) groeiden veel sneller dan de cellen in de controlegroep (Figuur 2B). Om te bevestigen dat Y-27632 de groei van HMEC bevordert, werden de bevroren P0-cellen ontdooid en geplateerd met of zonder toevoeging van 10 mM Y-27632, en werden passage 1 (P1)-cellen op verschillende dagen verzameld, zoals weergegeven in figuur 3. De cellen werden geanalyseerd op levensvatbaarheid en proliferatie met behulp van de celtelling-kit-8 (CCK-8). Zoals te zien is in figuur 3, was de groeisnelheid van cellen behandeld met Y-27632-bevattend medium significant hoger dan die van de cellen in de controlegroep zonder Y-27632. Als we deze gegevens samennemen, kan worden gezien dat de toevoeging van Y-27632 in het oorspronkelijke medium de groei van de aangehechte cellen na isolatie aanzienlijk bevordert.
Om te verifiëren dat de cellen die met deze methode worden verkregen HMEC's zijn, hebben we immunofluorescentieanalyse uitgevoerd van P0 HMEC's voor twee borstepitheelcelmarkers: CK7 en GATA3. CK7, een diagnostisch belangrijke cytokeratine, is een marker van klierdifferentiatie in normaal borstepitheel en zijn proliferatieve epitheelprocessen13. Bovendien hebben Kouros-Mehr et al. gerapporteerd dat GATA3 functioneert als een transcriptiefactor in borstepitheelcellen en betrokken is bij het ondersteunen van de luminale epitheliale differentiatie in volledig ontwikkelde borstklieren14. Zoals te zien is in figuur 3, brengen de cellen die we hebben gekweekt en uitgebreid sterk zowel CK7 (Figuur 4A) als GATA3 (Figuur 4B) tot expressie. De kwantificeringsanalyse van zowel CK7- als GATA3-positieve cellen toonde aan dat meer dan 98% van de cellen zowel CK7 als GATA3 tot expressie bracht (Figuur 4C), wat wijst op beperkte besmetting van andere soorten cellen, zoals fibroblasten. We zagen af en toe een beperkt aantal fibroblastachtige cellen (langwerpige morfologie) in de initiële cultuur (P0, Figuur 2), maar we zien deze cellen zelden verschijnen in de gepassageerde cellen (P3, Figuur 4D).
Om te testen of de epitheelkarakteristiek van HMEC's na verschillende passages kan worden behouden, hebben we de qRT-PCR-analyse uitgevoerd van borstepitheelcelmarkers CK7 en GATA3 in de cellen gekweekt met of zonder Y-27632 (Figuur 5). De expressieniveaus van zowel CK7 als GATA3 waren niet significant verschillend in zowel P0- als P3-cellen, met of zonder Y-27632, wat aangeeft dat hun fenotypische en differentiatiekenmerken in de loop van de tijd niet veranderden tijdens de kweekuitbreiding.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig01.jpg"> Figuur 1: Stroomschema van het protocol voor het isoleren en kweken van HMEC's. Aanvankelijk werden vrouwelijke borstweefselfragmenten gesneden met chirurgische messen en verteerd met een combinatie van enzymen. Vervolgens werden de verkregen celpellets gekweekt in een initieel kweekmedium dat 10 mM Y-27632 bevatte. Na 2 dagen werd het oorspronkelijke kweekmedium vervangen door epitheelcelmedium. De borstepitheelcellen werden gekweekt in epidermaal celmedium om na ~8 dagen een bevredigende dekking te bereiken, nu geschikt om te passeren. Indien nodig kunnen sommige cellen worden onderworpen aan celcryopreservatie. Afkorting: HMECs = menselijke borstepitheelcellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig02.jpg"> Figuur 2: Beelden van HMEC's verkregen na de eerste inoculatie. Binnen 2 dagen na inoculatie werden (A) primaire HMEC's gekweekt in het initiële medium dat Y-27632 bevatte en (B) primaire HMEC's werden gekweekt in het initiële medium zonder Y-27632. Na een kweekperiode van 48 uur werd in beide groepen het serumvrije keratinocytenkweekmedium vervangen. Om de dag werden foto's gemaakt om de groeistatus van cellen vast te leggen. Beide reeksen representatieve beelden zijn gemaakt met een omgekeerde microscoop (100x) op dag 3, 5 en 9 na inoculatie. Schaal balken = 100 μm. Afkorting: HMECs = menselijke borstepitheelcellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig03.jpg"> Figuur 3: Verbeterde groei van Passage 1 HMEC's (P1) met Y-27632. De ingevroren P0-cellen werden ontdooid en gekweekt met of zonder Y-27632. De cellen (P1) werden verzameld op 1, 3, 5, 7 en 9 dagen en de absorptie werd geanalyseerd bij 450 nm met behulp van de CCK-8-kit. Op dag 1 was het aantal aanhangende levensvatbare cellen in het oorspronkelijke medium dat Y-27632 bevatte significant hoger dan dat zonder Y-27632. Bovendien vertoonde de groeicurve van cellen die met Y-27632 werden behandeld een sterkere toename. **p < 0,01, ***p < 0,001. Afkorting: HMECs = menselijke borstepitheelcellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig04.jpg"> Figuur 4: Expressie van HMEC-markers (P0). De expressie van CK7 en GATA3 in HMEC's werd geanalyseerd door middel van immunofluorescentiekleuring. HMEC's werden gekleurd voor (A) CK7 (rood) en (B) GATA3 (rood); DAPI (blauw) werd gebruikt om de kernen te kleuren. De foto's zijn gemaakt met een confocale lasermicroscoop (400x). Schaalbalken = 20 μm. (C) Het percentage positieve cellen in kleuring; (D) het representatieve beeld van HMEC's (P3). Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig05.jpg"> Figuur 5: De expressie van CK7 en GATA3 van HMEC's op P0 en P3. QRT-PCR gebruiken om expressie te detecteren van (A) CK7 in HMEC's van P0 en P3 op dag 7, (B) GATA3 in HMEC's van P0 en P3, (C) CK7 in P1 HMEC's gekweekt met of zonder Y27632 op dag 7, (D) GATA3 in P1 HMEC's gekweekt met of zonder Y-27632 op dag 7. nsp > 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De huidige studie rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol om primaire menselijke borstepitheelcellen (HMEC's) efficiënt te isoleren en te laten groeien uit kleine hoeveelheden borstweefsel. Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's, zowel voor laboratorium- als klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Ons onderzoek richt zich op het ophelderen van de behandelingsmogelijkheden voor refractaire granulomateuze mastitis. Door gebruik te maken van een integratieve benadering die traditionele Chinese en westerse medische methodologieën tegelijkertijd combineert, zullen de complexe pathogene mechanismen die de ziekte en de complicaties ervan veroorzaken, blootleggen, met een focus op het verlichten van deze problemen en het verbeteren van de prognose van de patiënt. Ons onderzoek rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol voor het efficiënt isoleren en kweken van primaire menselijke borstepitheelcellen, of HMEC's, uit een kleine hoeveelheid borstweefsel.Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's voor laboratorium- en klinische toepassingen. Voortbouwend op deze studie willen we een granulomateuze mastitis borstepitheelcelmodel ontwikkelen om ons begrip van etiologie en gevalideerde behandelingsstrategieën te verdiepen.

isolation-and-culture-of-primary-human-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's), rijk aan myofibroblasten aanwezig in de tumor stroma, spelen een belangrijke rol in het besturen van tumorprogressie. We ontwikkelden een coimplantation tumor xengraft model voor het genereren van experimenteel CAFS uit humane fibroblasten borstklieren. Het protocol beschrijft hoe om vast te stellen CAF myofibroblasten dat het vermogen om tumorgenese bevorderen verwerven.

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

We beschrijven een 3D-kweekmodel van het menselijk borstpijtheel dat geschikt is om hormoonwerking te bestuderen.

Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Leer een efficiënte methode voor het isoleren en kweken van primaire humane mammaire epitheelcellen (HMECs) uit beperkt weefsel. Dit protocol versnelt onderzoek naar granulomateuze mastitis en verbetert klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Meer video's verkennen