Het voorbereiden van een muizenmodel van ernstige acute pancreatitis via een combinatie van caeruleïne en lipopolysaccharide intraperitoneale injectie

De behandeling van ernstige acute pancreatitis is moeilijk vanwege de hoge sterftecijfers met behulp van diermodellen, met name muizen met een door C57BL/6J geselecteerde achtergrond. We onderzoeken SAP als pathologisch om therapeutische doelen te identificeren en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, waarbij we de polymice-methode leveren bij het ene SAP-onderzoek.

Dit onderzoek bracht een hoge expressie van HMGB1-genen aan het licht die beschadigde pancreatitis veroorzaken, wat suggereert dat het verband houdt met de ontstekingssteen van ernstige acute pancreatitis. Ons protocol houdt in dat caeruleïne de samentrekking van de galblaas induceert en het vasten bij muizen verstoort, wat leidt tot beschadiging van het pancreasweefsel door de afscheiding van spijsverteringsvloeistof te blokkeren. In combinatie met LPS-injectie induceerden we ernstige pancreatitis met orgaanfalen bij muizen. Deze aanpak is niet-invasief en eenvoudig te implementeren met korte cycli en een hoge herhaalbaarheid.

[Demonstrant] Meet en registreer om te beginnen het gewicht van de experimentele muis. Voor intraperitoneale injectie van caeruleïne pakt u de muis vast en houdt u deze vast met de buik naar boven en het hoofd lager dan de staart. Houd de spuit in de rechterhand en steek de naald in de onderhuidse huid aan de linkerkant van de witte buiklijn. Beweeg de naald ongeveer drie tot vijf millimeter naar voren en steek deze in een hoek van 45 graden in de buikholte. Houd de naald stil en injecteer langzaam de caeruleïne. Trek de naald naar buiten, masseer vervolgens zachtjes en druk op de injectieplaats met een steriel wattenstaafje om het medicijn volledig in de buikholte te verspreiden. Plaats de muis 12 uur na injectie in het midden van het raster in de experimentele doos, van de onderzoeker af gericht. Schakel de videotrackingsoftware in en stel de monitoring in voor vier gelijktijdige gezichtsvelden. Markeer de lengte en breedte van het experimentele object dat binnen de doos kan bewegen in het real-time monitoringscherm. Registreer de muisactiviteit gedurende 15 minuten. Macroscopische veranderingen gemeten in het muizenmodel voor pancreasletsel tijdens de vijf cycli toonden aan dat muizen in groep 5 van pancreasletsel binnen drie minuten een lage bewegingsafstand behielden, terwijl de immobiliteitsratio binnen drie minuten toenam met elke volgende cyclus. Pancreasletsel Groep 5 vertoonde de kleinste totale bewegingsafstand in vergelijking met de andere experimentele groepen, en het verschil was statistisch significant. Met uitzondering van de controle- en pancreasletselgroep 1 vertoonden alle groepen een negatieve gewichtsgroei met een D-waarde, waarbij de pancreasletselgroep 5 de grootste verandering vertoonde. De analyse van het overlevingspercentage wees op dag vijf op een sterftecijfer van 80% in groep 5 voor pancreasletsel, in tegenstelling tot de andere groepen die geen significant verschil vertoonden met de controlegroep. Na 36 uur intraperitoneale injectie van caeruleïne, euthanaseer en zet de muis in rugligging vast op een schuimplaat. Maak een incisie in de middenberm en draai de dunne darmbuis naar rechts om de alvleesklier bloot te leggen. Koppel de twaalfvingerige darm en de ductus pylorusa los. Zoek de dunne darm onder de alvleesklier en maak vervolgens het pancreasweefsel langs het darmkanaal volledig vrij. Klem met een tandeloze tang de milt vast en trek deze voorzichtig omhoog. Ontleed het weefsel van de achterste pancreasligament scherp tot aan de kop van de alvleesklier. Koppel vervolgens het galkanaal en de bloedvaten los. Verwijder het pancreasweefsel uit de buikholte en dep het oppervlaktevocht droog met absorberend papier. Meet en registreer het gewicht van het pancreasweefsel. Na het bereiden van paraffinesecties, ontwas de pancreasweefsels twee keer in xyleen gedurende elk vijf minuten. Behandel elke sectie met 100 microliter proteïnase K en incubeer gedurende 37 minuten bij 20 graden Celsius. Voeg de benodigde hoeveelheid 3% waterstofperoxide toe aan het weefsel en incubeer gedurende 20 minuten om het volledig te infiltreren. Bedek het hele gebied van het monster met 50 microliter evenwichtsbuffer en incubeer gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 56 microliter TDT-incubatiebuffer toe aan elk weefselmonster en incubeer gedurende een uur. Was de weefselsecties vier keer met PBS gedurende vijf minuten voordat ze 30 minuten worden geïncubeerd in 100 microliter Streptavidin-HRP-reactieoplossing. Voeg voor DAB-kleuring 50 microliter DAB toe aan elk weefselgedeelte. Dompel de secties drie tot vijf minuten onder in hematoxylinekleuringsoplossing voordat u ze afspoelt met zuiver water. Dehydrateer de monsters met vier rondes verse watervrije ethanol gedurende elk vijf minuten. Voer een histologisch onderzoek uit onder een witlichtmicroscoop. TUNELKLEURING op de pancreasweefsels van muizen onthulde een toename van cellulaire necrose in de pancreasletselgroep 5, met significant hogere grijsschaalwaarden en positieve necrosepercentages in vergelijking met andere groepen. Eiwitimmunoblotting beoordeelde Caspase-3-expressie, een marker van cellulaire necrose, en toonde een significante toename van de weefsels van groep 5 voor pancreasletsel. Flowcytometrie van acinaire celsuspensies van de pancreas, gelabeld met een Nexin 5 fit CPI, duidde op een opmerkelijk hoger celsterftecijfer in groep 5 voor pancreasletsel in vergelijking met andere, met statistische significantie.