Isolatie van kernen uit menselijk intermusculair vetweefsel en stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern
3 mei 2024
De biologie van intermusculair vetweefsel (IMAT) is grotendeels onontgonnen vanwege de beperkte toegankelijkheid van menselijk weefsel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor kernisolatie en bibliotheekvoorbereiding van bevroren menselijke IMAT voor sequencing van enkelvoudige kernen RNA om de cellulaire samenstelling van dit unieke vetdepot te identificeren.
Onze onderzoeksgroep probeert inzicht te krijgen in de celsamenstelling en celspecifieke transcriptieprofielen van intermusculair vetweefsel of IMAT bij mensen. IMAT is eigenlijk een ectopisch vetdepot dat zich tussen en rond spiervezels bevindt. Computertomografie en MRI hebben het IMAT-volume kunnen kwantificeren en hebben onlangs aangetoond dat het toeneemt met zowel de leeftijd als de BMI, en ook in verband wordt gebracht met spierdegeneratieve ziekten.
In vitro secretoomstudies hebben onlangs aangetoond dat door IMAT uitgescheiden eiwitten het vermogen hebben om de insulinegevoeligheid, ontstekingsprofielen en ook contractiele eiwitexpressies in menselijke skeletspieren te beïnvloeden. De beperkte hoeveelheid IMAT-weefsel die tijdens biopsieën wordt verzameld en de met lipiden beladen aard van adipocyten maken dit weefsel onverenigbaar met weefselvertering en eencellig RNA-Seq. Daarom wilden we een protocol ontwikkelen dat kernisolatie uitvoerde op kleine hoeveelheden weefsel dat vervolgens kon worden gebruikt in stroomafwaarts enkelvoudige enkelvoudige RNA-Seq.
Dit protocol zal onderzoekers in staat stellen om de samenstellings- en celspecifieke transcriptieveranderingen te bepalen die optreden in IMAT in verschillende metabole ziektetoestanden en als reactie op interventies. We hopen dat deze informatie cruciaal zal zijn bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën om stofwisselingsziekten te helpen verlichten door IMAT rechtstreeks aan te pakken of de uitgescheiden factoren ervan. Het veld heeft een ernstig gebrek aan gegevens over de biologie van IMAT, de cellulaire oorsprong en communicatie met andere cellen, die zowel binnen als buiten IMAT wonen, evenals de moleculaire reacties op leefstijlinterventies, zoals voeding en lichaamsbeweging of farmacotherapie.
Dit zijn allemaal belangrijke onderzoeksvragen voor onze groep.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cellulaire samenstelling en specifieke transcriptionele profielen van intermusculair vetweefsel (IMAT) bij mensen, een minder onderzocht gebied vanwege de beperkte toegankelijkheid van het weefsel. Een gedetailleerd protocol voor kernisolatie en library-preparatie voor single nuclei RNA-sequencing wordt gepresenteerd om de identificatie van cellulaire componenten binnen dit unieke vetdepot te vergemakkelijken.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Biologie van intermusculair vetweefsel (IMAT)
- Cellulaire samenstelling en functie
- Impact op metabole ziekten
Achtergrond
- IMAT is een ectopisch vetdepot dat zich tussen spiervezels bevindt.
- Het volume hiervan neemt toe met de leeftijd en BMI, wat correleert met degeneratieve spierziekten.
- De secretie van eiwitten vanuit IMAT beïnvloedt de insulinegevoeligheid en ontsteking in skeletspieren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van kernen uit kleine monsters van menselijk IMAT-weefsel
- RNA-sequencing van enkelvoudige kernen
- Protocolontwikkeling voor het hanteren van lipiderijk vetweefsel
Belangrijkste resultaten
- Ontwikkelde een protocol waarmee onderzoekers de cel-specifieke transcriptomica van IMAT kunnen analyseren.
- Faciliteerde de identificatie van cellulaire veranderingen bij metabole ziektebeelden en interventies.
- Verbeterde het begrip van de rol van IMAT in de metabole gezondheid.
Conclusies
- De studie biedt waardevolle inzichten in de biologie van IMAT.
- De bevindingen kunnen leiden tot nieuwe therapeutische strategieën die zich richten op IMAT bij metabole ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Single-nuclei RNA-sequencing van menselijk intermusculair vetweefsel (IMAT) vult een kritisch gat in het begrip van de depot-specifieke cellulaire samenstelling en transcriptionele toestanden die relevant zijn voor metabole ziekten en degeneratieve spierziekten. Dit protocol maakt high-resolution profiling mogelijk vanuit beperkt biopsiemateriaal, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege ontdekking en targetvalidatie voor portfolio's gericht op metabole ziekten. Deze benadering verbetert de mechanistische risicoreductie op het snijvlak van vetweefsel- en spierbiologie, wat bijdraagt aan translationeel onderzoek en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar IMAT-specifieke cellulaire heterogeniteit en transcriptionele programma's mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door celtype-specifieke genexpressie-signaturen te onthullen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor targets bij metabole ziekten en spierziekten.
- Biedt fundamentele gegevens voor het prioriteren van depot-specifieke interventiestrategieën.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde kernsuspensies voor die geschikt zijn voor high-throughput single-nuclei RNA-seq workflows.
- Standaardiseert de monsterverwerking van lipiderijke, beperkte menselijke weefselbiopten.
- Maakt reproduceerbare detectie van zeldzame en laag-abundante celpopulaties mogelijk.
- Ondersteunt kwantitatieve transcriptomische read-outs voor downstream evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt cellulaire IMAT-profielen uit met ziekterelateerde metabole en spierfenotypes.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekkingen in menselijk weefsel tot validatie in preklinische modellen.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers die gekoppeld zijn aan de IMAT-biologie.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van therapeutische programma's gericht op depotweefsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor kernisolatie en sequencing is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek naar metabole ziekten en spierziekten, wat een robuuste doelwitvalidatie en translationele continuïteit mogelijk maakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot de cellulaire samenstelling van IMAT en de invloed van het secretoom op spierweefsel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kernpreparaten voor schaalbare transcriptomische assays.
- Analytiek: Verschaft kwantitatieve single-nuclei RNA-seq data voor vergelijkende analyse tussen ziektestadia en interventies.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen bevindingen in menselijk weefsel en de ontwikkeling van preklinische modellen en biomarkerontdekking.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar protocol voor het profileren van andere uitdagende vetdepots of beperkte biopsiemonsters.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van IMAT-gerelateerde targets en het mechanistische begrip.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie van kernen uit lipiderijke, beperkte menselijke weefsels voor reproduceerbare downstream-analyse.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk voor depot-gerichte therapeutische programma's en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van activa voor metabole ziekten en spierziekten op basis van gegevens uit menselijk weefsel.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, isolatie van kernen en het voorbereiden van single-nuclei RNA-seq bibliotheken.
- Vraagt toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor het tellen van kernen en droplet-gebaseerde sequencing.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de workflows van monstervoorbereiding en data-analyse.
- Kan aanpassing vereisen voor andere adipose depots of weefseltypen met een verschillend lipidegehalte.
- Beperkt door de hoeveelheid en kwaliteit van het beschikbare menselijke biopsiemateriaal voor analyse.
