Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners

In dit protocol willen we een gemakkelijk te volgen, stapsgewijze zelfstudie bieden over het verzamelen en bewaren van perifeer bloed en mononucleaire cellen met een hoge levensvatbaarheid of PBMC's uit volbloed. PBMC's omvatten lymfocyten, dendritische cellen en monocyten. Bulk PBMC's kunnen worden verwerkt om individuele celtypen te isoleren en worden vaak gebruikt in een breed scala aan experimenten en assays, waaronder RNA-sequencing en flowcytometrie.

Naast PBMC's laten we ook zien hoe je EDTA-plasma en hele buffy coat kunt verzamelen. Voordat u met dit protocol begint, dient u de materialen en reagentia voor te bereiden die in tabel 2 worden vermeld. Houd er rekening mee dat dit protocol is ontworpen voor het verzamelen van PBMC's uit zes dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuizen, die elk ongeveer 12 miljoen cellen opleveren.

Schaal dienovereenkomstig. Verzamel met behulp van de standaard aderlatingstechniek volbloed in zes dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuisjes en één EDTA-buisje totdat het gevuld is. Centrifugeer alle buisjes op 1800g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Indien nodig kunnen verzamelde buisjes maximaal vier uur worden opgeslagen en vervolgens tegelijkertijd worden verwerkt. Raadpleeg aanvullende video 1 voor een demonstratie van het bedienen van een centrifuge. Na centrifugatie van de buis met het dichtheidsgradiëntmedium zullen plasma en PBMC's zich boven het dichtheidsgradiëntmedium bevinden.

Erytrocyten en granulocyten zullen naar de bodem bezinken. Zie Afbeelding 1A voor een visualisatie. Open na het centrifugeren voorzichtig de centrifugatiebuis met dichtheidsgradiënt.

Gebruik een transferpipet om de doorschijnende gele laag met plasma te verwijderen en weg te gooien. Verstoor de wazige laag cellen direct boven het dichtheidsgradiëntmedium niet. Neem het zekere voor het onzekere om overtollig plasma achter te laten in plaats van PBMC's weg te gooien.

Herhaal dit voor alle tubes. Met een nieuwe transferpipet pipetteert u het resterende volume met cellen en restplasma in elk buisje voorzichtig op en neer boven het dichtheidsgradiëntmedium. Na resuspensie pipetteert u de geresuspendeerde inhoud van het buisje in een gelabeld conisch buisje van 50 ml.

Herhaal dit voor alle tubes. Vul de slang van 50 ml tot aan de lijn van 50 ml met oplossing 1 door te gieten. Centrifugeer de tube van 50 ml op 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Het protocol voor het verzamelen van plasma en buffy's dat in sectie 2 wordt beschreven, kan gedurende deze periode worden voltooid. Na centrifugeren bevat de pellet PBMC's en het supernatans bevat bloedplaatjes en restplasma. Gooi zoveel mogelijk supernatans weg.

Tik indien nodig om achtergebleven druppels te verwijderen. Giet een tube van 15 ml oplossing 2 in de conische buis van 50 ml met de PBMC-pellet. Keer de buis voorzichtig om om de pellet opnieuw te suspenderen.

Zuig 15 ml oplossing 3 op met behulp van een transferpipet. Voeg druppelsgewijs toe aan de tube van 50 ml. Oplossing 3 bevat DMSO, dat bij kamertemperatuur giftig is voor cellen.

Voeg pas oplossing 3 toe als deze klaar is om onmiddellijk te worden verwerkt. Keer de tube drie keer voorzichtig om om te mengen. Vul elke voorgeëtiketteerde en voorgekoelde cryoflacon met 1 ml PBMC's met behulp van een multi-doseerpipet.

Raadpleeg aanvullende video 2 voor een demonstratie van het gebruik van een pipet met meerdere doseringen. Plaats de cryo-injectieflacons in een voorgekoelde vriescontainer. Verplaats de container vervolgens naar een vriezer van min 80 graden Celsius.

Bewaar de cryoflacons minimaal 12 uur in de vriescontainer. Breng vervolgens over naar een gelabelde opbergdoos bij min 80 graden Celsius. U kunt de bevroren cryoflesjes ook overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

Na centrifugeren bestaat de bovenste laag uit plasma, de onderste bevat erytrocyten en de interface zijn de buffy coats. Zie Figuur 1B voor een visualisatie. Zuig met een nieuwe transferpipet zoveel mogelijk plasma op zonder de buffy vachtlaag te verstoren.

Doseer vervolgens 0,5 ml aliquots in vooraf geëtiketteerde cryoflacons. Zuig de buffy vachtlaag op en breng deze over naar de correct geëtiketteerde cryoflacon. Houd er rekening mee dat sommige plasma's en erytrocyten de buffy coat-collectie kunnen besmetten.

Bewaar de cryoflesjes na het verzamelen in een vriezer van min 80 graden Celsius. U kunt het ook opslaan in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Voordat u met het PBMC-ontdooiprotocol begint, dient u de materialen en reagentia voor te bereiden die in tabel 3 worden vermeld.

Dit protocol is ontworpen voor het ontdooien van een buisje van 1,5 ml met ongeveer 2 miljoen cellen. Schaal dienovereenkomstig. Houd er rekening mee dat het absolute aantal cellen aanzienlijk kan verschillen tussen verschillende patiënten en verschillende behandelingsomstandigheden.

Breng bevroren PBMC's over uit de opslag met behulp van droogijs en ontdooi ze ongeveer 4 minuten in een incubator van 37 graden Celsius. Indien gewenst kan een aliquot worden genomen voor celtelling en levensvatbaarheidsmetingen zoals beschreven in sectie 4 van het schriftelijke protocol. Voeg na ontdooien 1 ml oplossing 4 toe aan elke cryoflacon.

Giet vervolgens de inhoud in een vooraf geëtiketteerde buis van 50 ml met 10 ml oplossing 4 voor elke ontdooide PBMC-buis. Tik om achtergebleven druppels te verwijderen. Plaats de celzeef op de lege buis van 50 ml en giet vervolgens de celsuspensie door de celzeef.

Tik indien nodig lichtjes om de oppervlaktespanning te onderbreken. Centrifugeer elke buis met de gezeefde cellen bij 400 g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Giet na het centrifugeren het supernatans met DMSO eruit.

Tik indien nodig om achtergebleven druppels te verwijderen. Resuspendeer de celpellet in het gewenste medium dat geschikt is voor stroomafwaartse experimentele behoeften, zoals celkweekmedia of flowcytometrie-antilichaamcocktails. Ga verder met uw experiment.

Na verzameling en cryopreservatie van PBMC werd de levensvatbaarheid van ontdooide PBMC's, monocyten en lymfocyten uit 56 unieke monsters beoordeeld door middel van flowcytometrie met behulp van reagentia vermeld in tabel 4 volgens de instructies van de fabrikant zoals weergegeven in figuren 2A tot en met F.A gemiddelde en standaarddeviatie levensvatbaarheid van PBMC's, monocyten en lymfocyten van 94 plus of min 4%98 plus of min 1,1% en 93 plus of min 5,6%, werd bereikt, weergegeven in figuur 2G. Levensvatbaarheidsmetingen door uitsluiting van trypanblauw leverden een gemiddelde levensvatbaarheid op van 88 plus of min 7,5% en een celgetal van 2,3 keer 10 tot de 6 plus of min 1,9 keer 10 tot de 6. Flowcytometrie-analyse toonde ook aan dat levende monocyten 17 plus of min 5,9% omvatten en lymfocyten 53 plus of min 13% van de totale PBMC's.

Vervolgens werden monocyten gesorteerd uit ontdooide PBMC's uit 59 unieke monsters door middel van flowcytometrie en ingediend voor bibliotheekvoorbereiding en RNA-sequencing zoals elders beschreven. Een gemiddelde en standaarddeviatie totale sequentie telling van 18 plus of min 16.3 miljoen werd bereikt met een 93 plus of min 6.3%read uitlijning en 49.6 plus of min 1.4 GC-inhoud zoals weergegeven in figuur 3A en B.A gemiddelde en standaarddeviatie uniek in kaart gebrachte leespercentage van 88 plus of min 3.6% werd gevonden met een subset van 56 unieke steekproeven. Deze parameters tonen aan dat zeer levensvatbare PBMC's die geschikt zijn voor downstream-toepassingen, waaronder hoogwaardige RNA-sequencing, kunnen worden verkregen door operators met elk niveau van laboratoriumtraining die dit protocol gebruiken.

Bij het uitvoeren van dit protocol is het van cruciaal belang om snel te werken om celdood te voorkomen, vooral na toevoeging van oplossing 3, die bij kamertemperatuur giftig is voor cellen. Daarnaast moeten de cellen ook voorzichtig worden behandeld om schade tot een minimum te beperken. Dit protocol biedt een efficiënte, gemakkelijk te volgen methode voor de isolatie van PBMC's, EDTA-plasma en buffy coat.

Deze immuuncellen kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan experimenten en tests die gericht zijn op de rol van het immuunsysteem in verschillende biologische contexten.