Name: Een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor het opbouwen van synthetische meersoortige biofilmgemeenschappen uit rhizosfeerbodem. Deze aanpak ondersteunt de ontwikkeling van tweede-generatie biofertilizers voor verbeterde plantengroei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (42307173 en 42107328) en het National Key Research and Development Program (2022YFD1500202 en 2022YFF1001800). P.W, Z.X ontwierp de studie. P.W, B.X, Z.C, J.X en N.Z analyseerden de gegevens en creëerden de cijfers. P.W schreef de eerste versie van het manuscript. Z.X., R.Z. en Q.S. hebben het manuscript herzien.

Dit protocol is algemeen toepasbaar op de bodemmicrobiota van verschillende planten in de rhizosfeer. Hier wordt komkommer als voorbeeld gebruikt. Details van de reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bacteriële isolatie
<ol><li>Rhizosfeer bodemisolatie<ol><li>De cultuur van de komkommer<ol><li>Desinfecteer komkommerzaden met een oplossing van 75% ethanol en 2% natriumhypochloriet (NaClO) en spoel ze vervolgens af in steriel water11.</li>
			<li>Ontkiem de zaden onder steriele omstandigheden en selecteer de zaden die het tweebladige stadium12 bereiken. Verplant vervolgens de consequent gekiemde komkommerzaailingen in potten met 2 kg zwarte aarde. OPMERKING: Twee soorten zwarte aarde van verschillende locaties in Noordoost-China worden gebruikt om systematische fouten te verminderen.</li>
		</ol></li>
		<li>Voorbereiding van de grondsuspensie<ol><li>Bereid PBS-S-buffer met behulp van de formulering: 6,33 g NaH2PO4· H2O, 16,5 g Na2HPO 4,7H 2O, 200 μL Silwet L-77 en 1 L gedestilleerd water.</li>
			<li>Wanneer de zaailingen het vierbladige stadium12 bereiken, keer je de pot om en isoleer je de wortels samen met 2 mm dikke rhizosfeergrond met behulp van gesteriliseerde handschoenen.</li>
			<li>Plaats de wortels in 30 ml PBS-S-buffer in een centrifugebuisje van 50 ml. Filtreer de suspensie na 20 minuten schudden door een nylon celfilter van 100 μm om wortels en grote sedimenten te verwijderen.</li>
			<li>Breng het filtraat over in een andere centrifugebuis van 50 ml, centrifugeer het gedurende 15 minuten op 3200 x g bij kamertemperatuur en bewaar het tijdelijk bij 4 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Extractie van bacteriële cellen in de rhizosfeer. OPMERKING: Deze methodologie maakt gebruik van de differentiële centrifugatiemethode13, hoewel de Nycodenz-dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode14 ook van toepassing is op deze stap.<ol><li>Verdun de grondsuspensie met een oplossing van 0,2% Na4P2O7 tot 500 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.000 x g om de organismen in eerste instantie van de grond te scheiden.</li>
		<li>Homogeniseer het precipitaat opnieuw, centrifugeer het gedurende 60 s op dezelfde lage snelheid en herhaal het proces drie keer. Combineer de supernatanten, centrifugeer ze gedurende 20 minuten op 12.000 x g en gooi het supernatant dan weg.</li>
		<li>Resuspendeer het neerslag in 50 ml PBS-S-buffer, die de bacteriële celsuspensie in de rhizosfeer vormt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sequentiebepaling en identificatie van de microbiota van de rhizosfeerbiofilm
<ol><li>Voorbereiding van de media OPMERKING: Tryptische sojabouillon (TSB) en minimale zouten glycerolglutamaat (MSgg) media zijn in de handel verkrijgbaar. De onderstaande formuleringen zijn alleen ter referentie.<ol><li>Bereid TSB-medium met de volgende formulering: 15 μg/ml trypton, 5 μg/ml sojapepton, 5 μg/ml NaCl, pH = 7.</li>
		<li>Bereid MSgg-medium met behulp van de volgende formulering: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM thiamine, 0,5% glycerol, 0,5% glutamaat, 50 μg/ml tryptofaan, 50 μg/ml fenylalanine, pH = 7.</li>
		<li>Om TSB-MSgg-media te bereiden, mengt u TSB-media met MSgg-media in een verhouding van 1:1 (v/v)15.</li>
	</ol></li>
	<li>Pellicle biofilm cocultuur<ol><li>Incubeer de celsuspensie in TSB-medium bij 30 °C 's nachts (meestal 12 uur) om de bacteriën te activeren.</li>
		<li>Plaats nylon celfilters van 100 μm op platen met 24 putjes. Incubeer de bacteriën in TSB-media en stel drie herhalingen in. Kweek de pellicle biofilm gedurende 36 uur bij 30 °C. OPMERKING: Als de pellicle-biofilm uit de laatste stap niet goed is gekweekt, is het TSB-MSgg-medium een effectieve vervanger voor het TSB-medium.</li>
		<li>Verwijder het filter met de pellicle biofilm. Voeg 2 ml PBS-S-buffer toe aan een nieuwe celplaat met 24 putjes, plaats het filter met 24 putjes erin om de biofilm te wassen en verwijder de vrije cellen. Herhaal het wasproces drie keer.</li>
	</ol></li>
	<li>Extractie van pellicle biofilm DNA<ol><li>Extraheer het biofilmgenoom met behulp van een DNA-kit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
	<li>Sequencing met hoge doorvoer OPMERKING: Biotechbedrijven kunnen helpen bij het voltooien van sequencing-experimenten voor de meeste laboratoria. Als de microbiële samenstelling in de resterende oplossing nodig is, sequentie dan in deze stap. De volgorde van de stap varieert afhankelijk van de instrumenten. Volg de instructies van de fabrikant. Stap 2.4.1 is alleen ter referentie.<ol><li>Amplificeer de V3-V4-regio's van het 16S rRNA-gen op basis van de database met 16S rRNA-gensequenties van volledige lengte. Creëer OTU's voor soorten op basis van het minimumaantal sequenties per monster16. Cluster de annotaties van de soortenclassificatie en verkrijg de samenstellingen van gemeenschappen uit elke steekproef.</li>
		<li>Op basis van de sequentiegegevens selecteer je de top vijf soorten in termen van hun relatieve overvloed.</li>
	</ol></li>
	<li>High-throughput bacteriële isolatie en kweek OPMERKING: Deze stap is ontworpen volgens de nieuwste microbiologische en bio-informaticamethodologie17. De verdunningsgecoate plaatmethode is hier beschikbaar voor bacteriële isolatie, hoewel deze tijdrovender en minder gericht is in vergelijking met high-throughput-technieken.<ol><li>Meng de gekweekte biofilm. Gebruik beperkende verdunning om ervoor te zorgen dat niet meer dan 30% van de putjes in de plaat met 24 putjes bacteriegroei vertoont. OPMERKING: Om de meest geschikte verdunning te bepalen, voert u voorbereidende experimenten uit met behulp van een breed scala aan verdunningssnelheden. De optimale verdunning mag niet meer dan twee kweekbare bacteriën per milliliter bevatten, wat neerkomt op bacteriële incubatie in minder dan 30% van de putjes.</li>
		<li>Amplificeer het 16S rRNA-gen van de bacteriën terwijl u labels voor de putjes en platen toevoegt en sequentie ervan met behulp van het high-throughput Illumina-platform17.</li>
		<li>Voer bio-informatica-analyses uit met behulp van in de handel verkrijgbare software om zuiverheid en taxonomische informatie over de soort voor elke cultuur te verkrijgen.</li>
		<li>Kweek de top vijf van overvloedige zuivere bacteriën door middel van continue lijncultuur en gebruik glycerol om de bacteriën bij -80 °C te behouden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bouw van synthetische microbiële gemeenschappen
<ol><li>Gereconstrueerde biofilmcultuur OPMERKING: Raadpleeg voor meer informatie Ren et al.18. De 5 stammen komen overeen met 31 synthetische combinaties, waaronder 5 consortia van één soort, 10 van twee soorten, 10 van drie soorten, 5 van vier soorten en 1 van vijf soorten.<ol><li>Incubeer de 5 stammen in het TSB-medium totdat hun OD600 1 bereikt om ze te activeren.</li>
		<li>Bereid meerdere platen met 24 putjes voor met TSB-medium en plaats er 100 μm nyloncelfilters op. OPMERKING: Als de biofilm uit de laatste stap niet goed is gekweekt, is het TSB-MSgg-medium een effectieve vervanger voor het TSB-medium.</li>
		<li>Incubeer de 31 combinaties van synthetische gemeenschappen in het medium. Zorg ervoor dat het inoculatieaantal bacteriën in elk putje consistent is. Stel drie herhalingen in voor elke combinatie.</li>
		<li>Kweek de biofilm gedurende 36 uur bij 30 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering van pellicle biofilm<ol><li>Volg dezelfde procedure als in stap 2.2.3.</li>
		<li>Breng de biofilm over op een nieuwe plaat met 24 putjes met 180 μl kristalviolette oplossing en kleur deze gedurende 20 minuten.</li>
		<li>Breng het gekleurde monster over naar een andere plaat met 24 putjes met 200 μl 96% ethanol, elueer het gedurende 30 minuten en meet OD590.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kwantificering van het aantal pelliclecellen
OPMERKING: Om het aandeel van elke soort en het celgetal in de pellicle en de resterende oplossing te bepalen, is kwantitatieve PCR noodzakelijk. Voor details, zie Sun et al.16.
<ol><li>Ontwerp stamspecifieke primers voor de geselecteerde synthetische microbiële gemeenschappen.</li>
	<li>Gebruik Roary om genoomvergelijkingen uit te voeren en de stamspecifieke single-copy-genen van elk isolaat te achterhalen. Zorg ervoor dat primers op deze genen zijn gericht.</li>
	<li>Ligase de versterkte fragmenten tot PMD19T-plasmiden. Genereer standaardcurven met behulp van de plasmiden met bijbehorende fragmenten als sjablonen.</li>
	<li>Volg dezelfde stappen als vermeld in stap 2.2.</li>
	<li>Bereid de reactiecomponenten als volgt voor: 7,2 μl H2O, 10 μl 2x qPCR Master-mix, 0,4 μl 10 μM van elke primer en 2 μl sjabloon-DNA.</li>
	<li>Voer de PCR uit met een real-time PCR-instrument onder de volgende omstandigheden: 95 °C gedurende 10 minuten, 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s en 60 °C gedurende 45 s, gevolgd door een standaard smeltcurvesegment.</li>
	<li>Voer voor elke behandeling zes biologische replicaten uit.</li>
</ol>

Ontwikkeling van synergetische multispecies biofilms uit de rhizosfeerbodem

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-growth-promoting+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-growth-promoting rhizobacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).</li>
<li>Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants%3A+Their+role%2C+colonization%2C+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li>
<li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li>
<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-microbiome+interactions%3A+From+community+assembly+to+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+velezensis+stimulates+resident+rhizosphere+Pseudomonas+stutzeri+for+plant+health+through+metabolic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions.</a> ISME J. 16, 774-787 (2021).</li>
<li>Pandhal, J., Noirel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+ecosystems+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial ecosystems for biotechnology.</a> Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).</li>
<li>Grosskopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial communities.</a> Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana.+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528, 364-369 (2015).</li>
<li>Bakken, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+bacteria+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of bacteria from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).</li>
<li>Yang, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+extraction+from+fresh+and+stored+soil+samples%3A+Impact+on+microbial+viability+and+community+compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions.</a> Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).</li>
<li>Ren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+multispecies+biofilm+formation+and+quantitative+PCR-based+assessment+of+individual+species+proportions%2C+useful+for+exploring+interspecific+bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions.</a> Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interactions+affect+the+biomass+of+synthetic+bacterial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities.</a> mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cultivation+and+identification+of+bacteria+from+the+plant+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota.</a> Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).</li>
<li>Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).</li>
<li>Palková, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+microorganisms%3A+Laboratory+versus+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions%3A+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Volgens het protocol wordt een reeks robuuste synthetische multispecies biofilmgemeenschappen geconstrueerd op basis van de microbiota in rhizosfeergrond van verschillende planten. Met behulp van kwantitatieve PCR-technieken wordt de samenstelling van elke gemeenschap duidelijk ontcijferd. De biomassa van de biofilm geeft de sterkte van hun potentiële metabole interacties aan, hoewel verschillende eigenschappen en mechanismen achter de samenwerking hier niet konden worden onthuld19. Gezien de omvang en complexiteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen, vormen synthetische gemeenschappen (SynComs) een modelsysteem voor het overwinnen van bestaande obstakels14. Dit protocol belicht de systematische en fundamentele methodologie voor het construeren van synthetische biofilmgemeenschappen uit complexe rhizosfeerbodemmicrobiota.
Uit het laatste deel blijkt dat SQR9, XL-1 en XL-2 een sterk potentieel vertonen voor stabiele kolonisatie in de werkelijke rhizosfeer. Onderzoekers kunnen beginnen met het onderzoeken van de metabole relaties en co-kolonisatiemechanismen op basis van deze stammen. Vervolgonderzoek naar microbiële inoculanten voor komkommer is daarna ook toegankelijk.
Ondanks de genoemde voordelen is het belangrijk om de nadelen van het protocol niet over het hoofd te zien. Vanwege verschillen tussen laboratoriumcultuur en in situ-omstandigheden , is het mogelijk dat de resultaten van elke synthetische gemeenschap de microbiota in echte rhizosfeerbodem niet nauwkeurig weergeven20. Bevestiging door verdere inoculatie in de rhizosfeer is noodzakelijk. Bovendien is de reproduceerbaarheid van deze resultaten relatief slecht. Pellicle biofilmsoorten in het laboratorium kunnen gedurende vele generaties mutaties hebben ondergaan in vergelijking met wilde typen in de bodem, wat heeft geleid tot enkele oncontroleerbare onnauwkeurigheden.
Er zijn verschillende alternatieven voor bepaalde stappen in het protocol. In stap 1.2 is de Nycodenz-dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode bijvoorbeeld relatief efficiënter voor het verzamelen van bodemcelmonsters13. Bovendien verhogen de nieuwste high-throughput teelt en identificatie van bacteriën in stap 2.4 de experimentele efficiëntie aanzienlijk, zij het tegen hogere kosten. Daarom blijft de traditionele verdunningsgecoate plaatmethode geschikt voor het selecteren van enkele soorten. Ten slotte kan in stap 3.2 de biomassa van gekweekte biofilm worden beoordeeld door zowel kristalvioletkleuring als door deze rechtstreeks op een analytische balans te wegen.
Dit protocol gaat verder dan alleen het creëren van experimenteel basismateriaal voor microbieel en milieuonderzoek. Het identificeren van de meest robuuste synthetische bacteriële multispecies biofilmgemeenschappen is slechts de eerste stap in het ontrafelen van het open en complexe rhizosfeer-ecosysteem. Door te focussen op de kernsoorten van SynComs kunnen onderzoekers gerichter en sneller inzicht krijgen in echte in situ situaties. Deze benadering kan ook een nieuw perspectief bieden voor het verkennen van biofilms op grotere schaal, zoals rhizosfeerbodemaggregaten, en voor nauwkeurig beheer van microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer voor plantengroei en gezondheid21.
Het belangrijkste is dat deze methodologie licht zal werpen op verder onderzoek naar interacties tussen soorten die de assemblage en dynamiek van de bodemmicrobiota in de rhizosfeer bepalen. Bij het omgaan met een complexe rhizosfeergemeenschap worden bijvoorbeeld vaak andere analytische methoden, zoals co-occurrence netwerkanalyse of metabole modellering op genoomschaal15 , gecombineerd met deze fundamentele stappen om kunstmatig een representatieve biofilmgemeenschap te construeren. Dit omvat overwegingen van relaties tussen soorten.

Biofilms vertegenwoordigen ingewikkelde microbiële gemeenschappen die op oppervlakken zijn aangebracht of met interfaces zijn verbonden. Er is een brede erkenning dat de meerderheid van de bacteriën die in verschillende omgevingen worden aangetroffen, zoals natuurlijke habitats, klinische omgevingen en industriële contexten, overleven binnen biofilmgemeenschappen1. In de bodem vormt de rhizosfeer - die het worteloppervlak en het aangrenzende 2 mm dikke gebied omvat - een ecologische niche met een verhoogde beschikbaarheid van voedingsstoffen. Specifieke bacteriën hebben strategieën ontwikkeld om deze niche te exploiteren, microbiële proliferatie te bevorderen en de vorming van biofilmgemeenschappen in de rhizosfeerte bevorderen 2.
Microben in de rhizosfeer worden beschouwd als het 'tweede genoom' van planten3. Plantengroeibevorderende micro-organismen (PGPM) gaan een mutualistische symbiose aan met planten en bieden aanzienlijke groeibevorderende en biologische controlefuncties4. Aan de ene kant kan PGPM voedingsstoffen leveren aan plantenwortels, de opname van voedingsstoffen verbeteren, zich verdedigen tegen ziekteverwekkers en verontreinigende stoffen in de rhizosfeerbodem afbreken5. Aan de andere kant gebruikt PGPM plantenwortelexsudaten als voedingsbron voor groei en evolutie, waardoor de rhizosfeerbodem en het wortelstelsel worden beïnvloed via hun eigen metabolisme. Het is vermeldenswaard dat de voorwaarde voor al deze functies de effectieve kolonisatie van PGPM in de rhizosfeer van planten is, waardoor stabiele biofilms worden gevormd6.
Biofilm van de rhizosfeer beïnvloedt het assemblageproces van microben in de rhizosfeer, en de temporele en ruimtelijke kenmerken van de assemblage van rhizosfeermicroben hangen nauw samen met de interactie van biofilm van meerdere soorten7. Het dient als de spil van plant-microbioominteracties en biedt een stabiele en controleerbare niche voor hen om effectief te interageren. Daarom is het bestuderen van biofilm in de rhizosfeer ook een belangrijke richting om inzicht te krijgen in de interactie tussen planten en microben.
Er is momenteel echter weinig onderzoek gedaan naar biofilms van meerdere soorten in de rhizosfeer. De hoge complexiteit van de samenstelling van het microbioom maakt het een uitdaging om fundamentele ecologische vragen rond natuurlijke microbiële gemeenschappen te beantwoorden8. Tijdens experimenten moet met veel omstandigheden rekening worden gehouden, zoals grondsoort, planttype en het grote aantal microbiële gemeenschappen. Verschillende factoren beperken het onderzoek naar multispecies biofilms in de rhizosfeer.
Om multispecies biofilmgemeenschappen uit de rhizosfeerbodem verder te onderzoeken, zoals synergetische interacties tussen soorten of kruisvoeding van metabolieten8, is het wenselijk om kunstmatig een vereenvoudigde, representatieve, stabiele en handelbare synthetische microbiële gemeenschap op te bouwen onder laboratoriumomstandigheden 9,10. Hier combineert een gestandaardiseerd protocol een aantal van de nieuwste microbiologische en bio-informaticatechnieken.

<table><tbody><tr><td>0.2 % Na4P2O7 solution</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td><td>20041418</td><td>Wordt gebruikt om de grondsuspensie te verdunnen.</td></tr><tr><td>100 &mu;m Nylon Cell Filter</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>F613463-0001</td><td>Wordt gebruikt om de kweekoplossing te filteren en de pellicle biofilm te scheiden.</td></tr><tr><td>2% NaClO solution</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td><td>L03336903</td><td>Wordt gebruikt om de zaden te steriliseren.</td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>Wordt gebruikt voor microbiële kweek en scheiding van pellicle biofilm.</td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2360010</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube</td><td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>Goed gedimensioneerde centrifugeerbuizen voor ons protocol.</td></tr><tr><td>75% C2H5OH solution</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td><td>801769680</td><td>Wordt gebruikt om de zaden te steriliseren.</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Stams geïsoleerd uit wortelgrond.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Stams geïsoleerd uit wortelgrond.</td></tr><tr><td>Bacteria DNA Kit</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>Wordt gebruikt om bacterieel DNA te extraheren.</td></tr><tr><td>Black Soil I</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Zwarte grond uit Jilin provincie.</td></tr><tr><td>Black Soil II</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Zwarte grond uit Heilongjiang provincie.</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Stams geïsoleerd uit wortelgrond.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10035048</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>Hogesnelheidscentrifuge.</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme Biotech Co.,Ltd.</td><td>Q311-02</td><td>Wordt gebruikt voor DNA amplificatie in qPCR.</td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td><td>NB026143</td><td>Wordt gebruikt voor aseptische operaties.</td></tr><tr><td>Constant Temperature Incubator</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto;"/></td><td>Wordt gebruikt voor microbiële kweek.</td></tr><tr><td>Cristal Violet Dye</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>A600331</td><td>Wordt gebruikt voor pellicle biofilm kleuring en kwantificering.</td></tr><tr><td>Cucumber Seed</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>'Jinchun I' komkommerzaad.</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor hoog-doorvoer wortelgrond bacteriële kweek en identificatie</td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011918</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Fridge</td><td>Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.</td><td>BCD-556WKPM(Q)</td><td>Wordt gebruikt voor stambehoud.</td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10010618</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Hydroponic Planting Basket</td><td>Yulv Furniture Store</td><td>6526262626</td><td>Wordt gebruikt voor komkommerhydrocultuur.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10017618</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>7791186</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10400101</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Msgg Medium</td><td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.</td><td>BES20791KB</td><td>Pellicle biofilm kweek medium.</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;7H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9390-100G</td><td>Wordt gebruikt om TSB media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>NaCI</td><td>Chinasun Specialty Products co., Ltd.</td><td>HS0416</td><td>Wordt gebruikt om TSB media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9638-25G</td><td>Wordt gebruikt om TSB media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>PBS-S Buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>Basis buffer voor levende weefsels.</td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>Wordt gebruikt om MSgg media voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>Wordt gebruikt voor staminculatie.</td></tr><tr><td>PMD19T Plasmid</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.</td><td>D102A</td><td>Wordt gebruikt om qPCR standaardcurves te genereren.</td></tr><tr><td>Pot</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td><td>YHHWS2401</td><td>Wordt gebruikt voor komkommer grondkweek.</td></tr><tr><td>Primer for qPCR</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor DNA amplificatie in qPCR.</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Instrument</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td><td>4484073</td><td>Wordt gebruikt om qPCR uit te voeren op geselecte

een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

De multispecies biofilm is een natuurlijk voorkomende en dominante levensstijl van bacteriën in de natuur, ook in de rhizosfeerbodem, hoewel het huidige begrip ervan beperkt is. Hier bieden we een aanpak om snel synergetische multispecies biofilmgemeenschappen tot stand te brengen. De eerste stap is het extraheren van cellen uit de grond van de rhizosfeer met behulp van de differentiële centrifugatiemethode. Vervolgens worden deze bodemcellen geënt in het kweekmedium om pellicle-biofilm te vormen. Na 36 uur incubatie wordt de bacteriële samenstelling van de biofilm en de oplossing eronder bepaald met behulp van de 16S rRNA-gen amplicon-sequentiebepalingsmethode. Ondertussen wordt high-throughput bacteriële isolatie uit pellicle biofilm uitgevoerd met behulp van de beperkende verdunningsmethode. Vervolgens worden de top 5 bacteriële taxa geselecteerd met de hoogste abundantie in de 16S rRNA-genamplicon-sequentiebepalingsgegevens (pellicle-biofilmmonsters) voor verder gebruik bij het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten. Alle combinaties van de 5 bacteriële taxa werden snel vastgesteld met behulp van een plaat met 24 putjes, geselecteerd op het sterkste biofilmvormingsvermogen door de kristalvioletkleuringstest en gekwantificeerd door qPCR. Ten slotte werden de meest robuuste synthetische bacteriële multispecies biofilmgemeenschappen verkregen via de bovenstaande methoden. Deze methodologie biedt een informatieve leidraad voor het uitvoeren van onderzoek naar biofilm van meerdere soorten in de rhizosfeer en het identificeren van representatieve gemeenschappen voor het bestuderen van de principes die de interacties tussen deze soorten beheersen.

Volgens de genoemde procedure worden significante gradiënten in biofilmvormend vermogen waargenomen van de bodemmicrobiota van de komkommer-rhizosfeer (figuur 1). De sequentiebepaling van biofilmamplicons bevestigde de soort in de pellicle (figuur 2). Op basis van de heatmapping van sequentiegegevens werden de top vijf van bacteriesoorten geselecteerd waarvan de abundantie in de pellicle groter is dan die in de resterende oplossing (Figuur 3). Hier werd een typische groep synthetische gemeenschappen als voorbeeld genomen. Kristalvioletkleuring en kwantitatieve PCR visualiseren direct de verschillen in pellicle-biomassa en de relatieve overvloed van elke soort in de gemeenschappen. Verhoogde cocultuurbiomassa geeft het succes aan van het construeren van synergetische multispecies biofilmgemeenschappen uit de rhizosfeerbodem (Figuur 4 en Figuur 5).
De resultaten laten zien dat Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 en Burkholderia cenocepacia XL-2 prominente synergetische consortia kunnen vormen, met de meest robuuste gemeenschap bestaande uit alle drie de soorten. Er wordt voorspeld dat ze een sterke synergie vertonen bij de vorming van biofilm. Het is ook opmerkelijk dat XL-1 dient als een 'dedicator'. Het bevordert de biofilmvorming van XL-2 en SQR9, ondanks de slechte groei en minimale abundantie in de consortia (Figuur 5). Hoewel een aantal multispecies cocultuurbiofilms een synergetisch fenotype vertegenwoordigen, zijn sommige soorten, zoals Chryseobacterium sp., altijd negatief gerelateerd aan andere stammen door de biomassa van synthetische biofilm te verminderen (Figuur 2). Hoewel dit fenomeen geen verband houdt met het doel van dit protocol, kan het in de toekomst de moeite waard zijn om verder te onderzoeken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg"> Figuur 1: Biofilmvorming van verschillende synthetische gemeenschappen (SynComs). Hier zitten de monsters in standaard platen met 24 putjes. De foto's worden zonder enige vergroting gemaakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg"> Figuur 2: Bacteriële samenstelling in pellicle en oplossing. De grafieken zijn gebaseerd op sequentiegegevens van 16S rRNA-genamplicons, vermeld in protocolstap 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg"> Figuur 3: Heatmap van het biofilmvormend vermogen in pellicle en oplossing. Rood staat voor de overvloed in biofilm, die hoger is dan de oplossing, en blauw staat voor het tegenovergestelde. Geslacht toonde geen verschil worden niet getoond. Soorten van de top 5 abundantie zijn aan de linkerkant aangevinkt. bb: zwarte biofilm; BS: Zwarte oplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg"> Figuur 4: Kwantificering van biofilmbiomassa van synthetische gemeenschappen in figuur 1. De gegevens zijn afkomstig van kwantificering van kristalviolet met OD = 590 nm. De gepresenteerde gegevens zijn het gemiddelde ± SD, n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg"> Figuur 5: Celaantallen en soorten, relatieve abundantie van synthetische gemeenschappen in Figuur 1. De gegevens zijn afkomstig van kwantitatieve PCR. De gepresenteerde gegevens zijn de gemiddelde ± SD, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een snelle en gestandaardiseerde procedure voor het opzetten van synergetische multispecies biofilmgemeenschappen uit verschillende rhizosfeerbodems wordt hier gepresenteerd. Het is een uniek protocol dat is ontworpen om de complexe bodemmicrobiota van de rhizosfeer te onderzoeken en te simuleren.

Een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

an-approach-to-constructing-multispecies-biofilm-communities-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Miquel Guennoc, C., et al. New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the preparation of a fungal culture on treated cellophane membranes to support colony formation and radial growth. It then shows the cultivation and preparation of soil bacterial cells for interaction assays. Finally, it illustrates how bacterial cells adhere to the fungal colony...

Establishing a Fungal-Bacterial Co-culture for Biofilm Formation

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor ecosysteem fabrikatie van apparaten (EcoFABs) waarmee de studies van planten en plant-microbe interacties in sterk gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.

Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.

Isolatie en analyse van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer en wortels in de overblijvende gras experimenten

Dit protocol beschrijft een cystic fibrosis (CF) longrelevant vier-species polymicrobieel biofilmmodel dat kan worden gebruikt om de impact van bacteriële interacties tussen soorten te onderzoeken.

Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken

We stellen een geoptimaliseerd Scanning Electron Microscopie-protocol voor voor het visualiseren van zeer heterogene en delicate monsters die planten- en schimmelbiomassa bevatten, samen met microbiota en biofilm. Dit protocol maakt het mogelijk om de ruimtelijke dimensies van de microbiota-organisatie te beschrijven.

Microbiota van attine mierentuinen: visualisatie van een microbieel landschap door scanning elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de assemblage van mini-bioreactorarrays die moeten worden gebruikt voor continue stroomcultuur van complexe fecale gemeenschappen onder anaërobe omstandigheden. We bespreken ook de methoden voor assemblage, inoculatie en bemonstering van de reactoren voor verdere analyse.

Bioreactorassemblage voor continue cultuur van complexe fecale gemeenschappen

Leer een gestandaardiseerde methode voor het opbouwen van synthetische meersoortige biofilmgemeenschappen uit rhizosfeerbodem. Deze aanpak ondersteunt de ontwikkeling van tweede-generatie biofertilizers voor verbeterde plantengroei.

Een benadering voor het construeren van biofilmgemeenschappen met meerdere soorten uit de bodem van de rhizosfeer

Meer video's verkennen