Bereiding van een enkele cel suspensie van epitheliale cellen uit de thymus van muizen en kleuring van intracellulaire moleculen voor analyse met flowcytometrie
26 juli 2024
We beschrijven protocollen voor de voorbereiding van een enkele cel suspensie van epitheliale cellen uit de thymus van muizen en de kleuring van intracellulaire moleculen voor flowcytometrische analyse.
T-cellen zijn immuuncellen die ons lichaam beschermen tegen infectieziekten en kanker. Thymus is een orgaan dat T-cellen aanmaakt en zich ontwikkelende T-cellen selecteert op basis van de zelfcomponenten van het lichaam. We zijn geïnteresseerd in hoe de thymus T-cellen produceert en selecteert die beschermend zijn voor ons lichaam en toch tolerant zijn voor het lichaam.
Ons lab heeft bijgedragen aan de analyse van thymusepitheelcellen, die een sleutelrol spelen bij de productie en selectie van T-cellen in de thymus. Analyse op celniveau van thymusepitheelcellen heeft ons geholpen het moleculaire mechanisme van de ontwikkeling en selectie van T-cellen beter te begrijpen. Thymusepitheelcellen zijn zeer divers met complexe structuren, waardoor hun isolatie een uitdaging is.
De huidige technologie voor het isoleren van eencellige suspensies is beperkt en moet worden verbeterd. Toch verbetert de isolatie van thymusepitheelcellen ons begrip van moleculaire machinerie die betrokken is bij hun ontwikkeling en functie. We hopen dat onze studie zal bijdragen aan het begrip van de generatie en regeneratie van immuuncellen.
Wij geloven dat het zal dienen als een belangrijke hoeksteen voor het bevorderen van de menselijke gezondheid. Nadat je de thymus van de muis hebt geoogst, plaats je deze in vijf milliliter RPMI 1640 met 10 millimolaire HEPES in een plastic schaaltje van 60 millimeter op ijs. Gebruik onder een ontleedmicroscoop een gebogen pincet met fijne punt om bloed, niet-thymus en vetweefsel te verwijderen.
Snijd de thymus in kleine stukjes met een ontleedschaar. Breng de thymusstukjes over in een tube van 15 milliliter met drie milliliter van één milligram per milliliter Collagenase en Dispase, en één eenheid per milliliter DNase in RPMI 1640 met 2% FBS. Incubeer de buis in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.
Meng vervolgens de suspensie met behulp van een plastic transferpipet van drie milliliter en blijf ongeveer 30 minuten incuberen of totdat de weefselfragmenten niet meer worden gezien. Voeg vijf milliliter vijf millimolaire EDTA toe in HBSS met 1% FBS. Filtreer de celsuspensie door een nylon gaas van 60 micron in een nieuwe buis van 50 milliliter.
Centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij 350 G bij vier graden Celsius en suspendeer de pellet opnieuw in 10 milliliter FACS-buffer. Bewaar de cellen op ijs en bepaal het aantal cellen met behulp van een cellenteller. Na het oogsten van de thymus van een neonatale muis, gebruikt u een gebogen pincet met fijne punt om bloed, niet-thymus en vetweefsel te verwijderen.
Breng de thymus over in een buis van 1,5 milliliter met 0,2 milliliter RPMI 1640 met 10 millimolaire HEPES. Gooi met behulp van een pipet van 200 microliter het medium weg en voeg vervolgens 0,5 milliliter 0,5 milligram per milliliter collagenase en dispase en één eenheid per milliliter Dnase toe in RPMI 1640 met 2% FBS. Incubeer de buis in een warmteblok bij 37 graden Celsius.
Meng tijdens de incubatie voorzichtig met een pipet van één milliliter. Voeg na 10 minuten 0,5 milliliter vijf millimolaire EDTA toe in HBSS met 1%FBS. Filtreer de celsuspensie door een nylon gaas van 60 micron in een nieuwe conische buis van 15 milliliter.
Voeg negen milliliter RPMI 1640 met 10 millimolaire HEPES toe aan de buis. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en suspendeer de pellet opnieuw in één tot drie milliliter FACS-buffer. Bewaar de cellen op ijs en bepaal het aantal cellen met behulp van een cellenteller.
Voeg om te beginnen 16 keer 10 toe aan de kracht van 6 neonatale of postnatale muizenthymuscellen in een buis van vijf milliliter polystyreen met ronde bodem. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 10 microliter werkconcentratie van anti-FC-receptor monoklonaal antilichaam in FACS-buffer.
Incubeer de buis gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Voeg elk 40 microliter anti-CD45 monoklonaal antilichaam, anti-EpCAM monoklonaal antilichaam, anti-Ly-51 monoklonaal antilichaam en UEA-1 toe in FACS-buffer. Meng de inhoud van een buisje en incubeer gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius.
Voeg na incubatie twee milliliter FACS-buffer toe. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en suspendeer de pellet opnieuw in een microliter Ghost Dye violet 510-oplossing. Meng de inhoud van een buisje en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Voeg nu twee milliliter FACS-buffer toe en centrifugeer de celsuspensie voordat u de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur fixeert met één milliliter 2% paraformaldehyde. Voeg 3,5 milliliter PBS toe aan de buis. Centrifugeer de celsuspensie bij 700G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius en permeabiliseer de cellen met één milliliter intracellulaire fixatie en permeabilisatiebuffer.
Meng de inhoud van een buisje en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer na incubatie de celsuspensie en voeg een milliliter permeabilisatiebuffer toe. Centrifugeer opnieuw de suspensie, voordat u 100 microliter werkconcentraties van anti-bèta5t-antilichaam of anti-CCL21-antilichaam toevoegt.
Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Voeg een milliliter permeabilisatiebuffer toe en centrifugeer de celsuspensie bij 700G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius. Voeg nu 100 microliter werkconcentraties anti-konijn IgG toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Na het toevoegen van de permeabilisatiebuffer, centrifugeert u de celsuspensie. Resuspendeer de celpellet in 200 microliter FACS-buffer en meng goed. Filtreer de celsuspensie door 60 micron nylon gaas voorafgaand aan cytometrische flowanalyse.
Flowcytometrische profielen van collagenase en dispase verteerden thymuscellen van muizen van nul dagen oud en muizen van twee weken oud toonden aan dat meer dan 90% van de deeltjessignalen levensvatbare cellen vertegenwoordigden. Fluorescerende signalen van levensvatbare cellen werden weergegeven door CD45 en EpCAM. Tijdens neonatale stadia kwamen cTEC's vaker voor dan mTEC's, maar postnataal domineerden mTEC's vanwege de lage cTEC-bevrijdingsefficiëntie.
Fixatie en permeabilisatie van cellen maken de detectie van intracellulaire moleculen in TEC's mogelijk. Beta5t-expressie werd gedetecteerd in de meeste cTEC's, maar niet in mTEC's. CCL21 werd gedetecteerd in een fractie van de mTEC's, maar niet in cTEC's.
Ter vergelijking: lucht werd uitgedrukt in een subpopulatie van mTEC's.
Overzicht
Dit artikel beschrijft protocollen voor het bereiden van enkelcel-suspensies van thymische epitheelcellen van muizen en de daaropvolgende analyse middels flowcytometrie. Inzicht in deze cellen is essentieel voor het begrijpen van de ontwikkeling en selectie van T-cellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- T-cellen zijn essentiële immuuncellen die beschermen tegen ziekten.
- De thymus is verantwoordelijk voor de productie en selectie van T-cellen.
- Thymische epitheelcellen spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van T-cellen.
- Single-cell analyse helpt bij het begrijpen van de mechanismen van T-celselectie.
Doel van de studie
- Om thymusepitheelcellen op single-cellniveau te analyseren.
- Om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de T-celontwikkeling te begrijpen.
- Om isolatietechnieken voor diverse thymusepitheelcellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van enkelcel-suspensies van thymusepitheelcellen van muizen.
- Kleuring van intracellulaire moleculen.
- Flowcytometrische analyse voor gedetailleerd onderzoek.
- Gebruik van geavanceerde isolatietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van diverse thymische epitheelcellen.
- Verbeterd inzicht in de mechanismen van T-celontwikkeling.
- Flowcytometrie leverde inzichten op in de expressie van intracellulaire moleculen.
- Protocollen zijn vastgesteld voor toekomstig onderzoek in de T-celbiologie.
Conclusies
- De studie draagt bij aan het begrip van de functies van thymusepitheelcellen.
- De protocollen kunnen worden toegepast voor verder onderzoek in de immunologie.
- De verkregen inzichten kunnen leiden tot vorderingen in T-celtherapieën.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
De bereiding van enkelcel-suspensies en intracellulaire kleuring van thymusepitheelcellen (TECs) van muizen maken een precieze analyse van de mechanismen van T-celontwikkeling op cellulair niveau mogelijk. Deze workflow ondersteunt mechanistische risicoreductie en targetvalidatie voor ontdekkingsprogramma's gericht op immunologie, in het bijzonder waar TEC-gestuurde selectie en tolerantie cruciaal zijn. Betrouwbare flowcytometrische analyse van TEC-subpopulaties informeert besluitvorming in vroege portfoliofasen en translationele continuïteit in immuunmodulerende strategieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele validatie mogelijk van TEC-geëxprimeerde moleculen die betrokken zijn bij T-celselectie en tolerantie.
- Ondersteunt mechanistische risicovermindering door onderscheid te maken tussen de bijdragen van corticale en medullaire TEC aan de vorming van het immuunrepertoire.
- Levert kwantitatieve gegevens ter ondersteuning van target-prioritisering en beoordelingen van biologische plausibiliteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gestandaardiseerde enkelcel-suspensies vast voor reproduceerbare flowcytometrische assays.
- Faciliteert de robuuste detectie van intracellulaire markers zoals beta5t en CCL21 in gedefinieerde TEC-subsets.
- Maakt assay-schaalbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies mogelijk voor platforms voor immuuncelprofilering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen door het karakteriseren van TEC-gestuurde mechanismen die ten grond liggen aan immuuntolerantie.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van doelwitten voor immuunmodulatie.
- Biedt een basis voor de ontwikkeling van biomarkers gekoppeld aan TEC-functie en T-celselectie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hoogresolutie-analyse van TEC-subpopulaties en hun moleculaire signaturen mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Bevordert hypothesetesten over TEC-gemedieerde T-celselectie en tolerantiemechanismen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve flowcytometrie-uitkomsten voor TEC-markerexpressie.
- Analytiek: Biedt data met resolutie op enkelcelniveau voor vergelijkende analyse van TEC-subsets en de prevalentie van markers.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten en preklinische modellen van immuunmodulatie en tolerantie.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Biedt een herbruikbaar protocol voor TEC-isolatie en -analyse binnen immunologie R&D-programma's.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van immuuntargets en vermindert mechanistische ambiguïteit in T-celselectiepaden.
- Operationele waarde: Standardiseert de isolatie van TEC en intracellulaire kleuring voor reproduceerbare, schaalbare flowcytometrie-workflows.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door robuuste gegevens te verschaffen over TEC-gestuurde immuunmechanismen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van immuunmodulatietargets mogelijk op basis van gevalideerde cellulaire mechanismen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefseldissociatie, flowcytometrie en protocollen voor intracellulaire kleuring.
- Vereist toegang tot geavanceerde flowcytometrische instrumentatie en analysesoftware.
- Noodzaakt standaardisatie van celpreparatie en kleuringsprocedures tussen teams voor de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende muizenleeftijden of frequenties van TEC-subpopulaties.
- Beperkte herstelpercentages van TEC's (1% cTEC's, 10% mTEC's) kunnen de doorvoer en steekproefgrootte beperken.
