Name: Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Leer hoe je DNA-dubbelstrengsbreukreparatie meet met luminescentie-gebaseerde reporter-assays. Deze methoden ondersteunen oncologisch onderzoek en versnellen de identificatie van nieuwe medicijndoelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Al het werk werd gefinancierd door Artios Pharma Ltd. Figuur 1 en Figuur 3 zijn gemaakt met Biorender.com.

Kwantificering van DNA Double Strand Break Repair met Nanoluciferase Reporter-assays

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S. en H.M.R.R. zijn allemaal werknemers en aandeelhouders van Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. is aandeelhouder van AstraZeneca PLC. S.J.B. is een oprichter, wetenschapper en aandeelhouder van Artios Pharma Ltd. Er is een patent aangevraagd op een aantal van de in deze studie geschetste melders (WO 2021/001647). Promega is de bron van de NanoLuc-technologie® en de gemodificeerde NanoLuc-polynucleotiden®. Artios Pharma werd door Promega geautoriseerd om de gemodificeerde NanoLuc-polynucleotiden® te genereren.

Hier hebben we protocollen beschreven voor het genereren en implementeren van een reeks extrachromosomale luminescentie-gebaseerde reporters voor het meten van de cellulaire vaardigheid van de vier belangrijkste DSBR-routes (HR, NHEJ, MMEJ en SSA)7. Reportersubstraten kunnen in cellen worden geïntroduceerd door voorbijgaande transfectie en worden gebruikt om DSBR-activiteit te beoordelen met behulp van een gevoelige en robuuste plaatgebaseerde uitlezing van NanoLuc-luminescentie, die wordt gereconstitueerd bij betrokkenheid bij betrokkenheid bij verwante cellulaire DSBR-routes.
Verschillende stadia van het genereren van reporter-substraten, transfectie van de substraten in cellen en gegevensinterpretatie zijn van cruciaal belang voor de succesvolle uitvoering van deze tests. Hoewel standaard moleculair-biologische technieken worden gebruikt om de reportersubstraten te genereren, zorgt het visualiseren van het proces door middel van gelelektroforese voor de hoogste kwaliteit en zuiverheid van de substraten voorafgaand aan transfectie. Aangezien deze tests afhankelijk zijn van voorbijgaande transfectie, zijn gemeenschappelijke overwegingen voor deze methoden van toepassing. Deze omvatten het optimaliseren van de zaaidichtheid, transfectiecondities (inclusief reagentia en DNA-hoeveelheden) en het beoordelen van de geschiktheid in voorwaartse en achterwaartse transfectieformaten. Deze reporter-assays zijn met succes uitgevoerd met een reeks elektroporatie- en lipofectieprotocollen, en de opties moeten volledig worden onderzocht voordat deze tests worden uitgevoerd. Er moet ook voor worden gezorgd dat de componentsignalen NanoLuc en Firefly worden geïnspecteerd in plaats van alleen het samengestelde reparatiesignaal dat wordt afgeleid door het NanoLuc-signaal (reportersubstraat) te normaliseren naar het Firefly-signaal (controle). Artefacten kunnen ontstaan doordat de verhouding wordt bepaald door veranderingen in het Firefly-signaal. Bijvoorbeeld, het beoordelen van remming in dosis-responsmodus met behulp van een zeer specifieke verbinding zou het NanoLuc-signaal op een titreerbare manier moeten onderdrukken zonder het Firefly-signaal te verstoren, dat stabiel zou moeten blijven (Figuur 4G,H). In gevallen waarin Firefly-signalen worden verstoord, kunnen nuttige effecten op reparatie echter nog steeds worden bepaald door een dosisvenster te identificeren waarin het Firefly-signaal niet wordt beïnvloed (Figuur 5).
Vergeleken met de meest gebruikte DSBR-reporter-assays, hebben deze extrachromosomale luminescentie-gebaseerde reporter-assays enkele duidelijke voordelen. Aangezien DSBR-routes sterk geconserveerd zijn, zelfs als de cellulaire machinerie varieert tussen celmodellen, kunnen de assays nog steeds rapporteren over DSBR-vaardigheid en routekeuze. Dit stelt de beoordeling van DSBR open voor elk model dat van belang is voor de gebruiker, zolang er van tevoren optimale transiënte transfectievoorwaarden worden vastgesteld.
Het gebruik van nanoluciferase als het reporter-gen biedt ook voordelen ten opzichte van fluorescerende opties, die traditioneel zijn gebruikt in DSBR-reporter-assays. NanoLuc is snel aan het rijpen en luminescentie wordt met hoge gevoeligheid gedetecteerd met behulp van een plaatlezer8. In combinatie met de snelheid van substraatreparatie (aangezien de reportersubstraten worden getransfecteerd in cellen met kant-en-klare DSB-uiteinden), is dit formaat van DSBR-reporter-assay ideaal voor de snelle doorlooptijd en kwantitatieve robuustheid die nodig is voor het screenen van kleine moleculen als onderdeel van een industriële cascade voor het ontdekken van geneesmiddelen. Inderdaad, we hebben onlangs de implementatie beschreven van de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter-assay in de ontdekkingscascade die wordt gebruikt voor de identificatie van kleine molecuulremmers van het Polθ-polymerasedomein13.
Er is ook flexibiliteit in de implementatie van de reporter-assays om specifieke vragen over genetische en farmacologische verstoringen van DSBR te beantwoorden (Figuur 3). Voorafgaand aan de transfectie van de reportersubstraten kunnen cellen bijvoorbeeld gedurende 48-72 uur worden getransfecteerd met siRNA tegen een gen van belang. Als alternatief kunnen de effecten van genoverexpressie op DSBR-routes worden getest door 24-48 uur voorafgaand aan de transfectie van reportersubstraten plasmidetransfectie uit te voeren. Voor farmacologische studies beschrijft het huidige protocol al hoe het gebruik van kleine moleculen kan worden opgenomen in de standaardworkflow, maar alternatieve formaten kunnen wijzigingen in samengestelde behandelingsregimes omvatten, zoals pre-incubaties of uitspoelingen.
De schaalbaarheid van transiënte transfectie zou ook grootschalige screeningsbenaderingen kunnen ondersteunen waarbij batchtransfectie van reportersubstraten wordt uitgevoerd voorafgaand aan de screening. Bovendien kan ook de duur van de test van transfectie tot uitlezing worden gevarieerd. Hoewel de standaardduur 16-24 uur kan zijn, kunnen sommige tests in slechts6 uur 7 worden uitgelezen. Bij het bepalen van de testduur moet ook rekening worden gehouden met bezorgdheid over toxiciteit van kleine moleculen of siRNA die de levensvatbaarheid van de cel in gevaar kunnen brengen.
Samenvattend bieden de tests die in deze studie worden beschreven en volledig worden beschreven in een recente publicatie7 een snelle en robuuste beoordeling van cellulaire DSBR-vaardigheid. Ze zijn zeer gevoelig en titreerbaar, waardoor ze vatbaar zijn voor zowel genetische als farmacologische studies. Cruciaal is dat, aangezien de reportersubstraten in cellen kunnen worden geïntroduceerd door voorbijgaande transfectie, ze het potentieel hebben om te worden gebruikt in elk transfecteerbaar celmodel van belang, in plaats van beperkt te zijn tot specifieke cellijnen door stabiele integratie zoals het geval is met chromosomale DSBR-reporters. Een duidelijke beperking van deze extrachromosomale tests van reporters is echter dat het gebrek aan integratie in het genoom de fysiologische, gechromatineerde context van DNA-herstel en de bijbehorende regulerende signalen en orkestratie mogelijk niet volledig recapituleert15. Daartoe zijn extrachromosomale reporter-assays een aanvulling op bestaande methoden voor DSBR-beoordeling en breiden ze de toolkit van middelen uit die geschikt zijn voor zowel fundamenteel onderzoek als de ontdekking van geneesmiddelen.

DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) vertegenwoordigen een bijzonder toxische klasse van DNA-schade1 waardoor cellen meerdere DSB-reparatieroutes (DSBR) hebben ontwikkeld om deze laesies te repareren. De vier belangrijkste DSBR-mechanismen zijn homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ), microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ) en enkelstrengs gloeien (SSA)2,3. DSBR-routes dragen bij aan het behoud van de ontwikkeling en fysiologie van gezond weefsel en beschermen tegen ziekten zoals kanker. Bovendien hebben deze reparatiemechanismen therapeutisch potentieel voor de ontwikkeling van modulatoren van kleine moleculen in de precisie-oncologie. Bijvoorbeeld, het richten op DNA-polymerase θ (Polθ), een cruciaal enzym in de MMEJ-reparatieroute, heeft interesse gewekt vanwege zijn synthetische letaliteit met HR-deficiëntie bij kanker4.
Het begrijpen van DSBR heeft daarom brede klinische implicaties en functionele cellulaire assays die in staat zijn om de activiteit van alle belangrijke DSBR-routes te meten, zijn nodig5. Assays moeten geschikt zijn voor zowel genetische als farmacologische ondervraging en inzetbaar zijn in verschillende celmodellen die van belang zijn. Om de inspanningen op het gebied van de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen te ondersteunen, moeten assays zeer gevoelig en titreerbaar zijn, een snelle doorlooptijd hebben en schaalbaar zijn naar high-throughput-formaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingen.
Over het algemeen is DSBR eerder gemeten met behulp van op fluorescentie gebaseerde reporter-assaysystemen die stabiel in het celgenoomzijn geïntegreerd 6. Hoewel fysiologische recapitulatie van chromosomale DSBR een duidelijk voordeel is, zijn dergelijke analyses beperkt tot een gastheermodel waarin de verslaggever is geïntegreerd, maken ze gebruik van arbeidsintensieve monstervoorbereiding en -analyse door middel van flowcytometrie en hebben ze een beperkte doorvoer, doorlooptijd, robuustheid en gevoeligheid, allemaal essentiële kenmerken die nodig zijn voor inspanningen om geneesmiddelen te ontdekken.
Hier beschrijven we een reeks DSBR-reportertests die beoordeling van de vier belangrijkste DSBR-routes mogelijk maken. De reeks reporter-assaysubstraten wordt geschetst in figuur 1 en verder beschreven in een recente publicatie7. Ze zijn extrachromosoom, waardoor ze in cellen kunnen worden geïntroduceerd door eenvoudige voorbijgaande transfectie, en de opname van een nanoluciferase-reporter-gen8, dat moet worden gereconstitueerd door betrokkenheid bij specifieke DSBR-mechanismen, zorgt voor gevoeligheid, robuustheid en schaalbaarheid. De volgende DSBR reporter substraatvarianten zijn opgenomen in het protocol (Figuur 1):
Resectie-onafhankelijke MMEJ: Dit lineaire substraat bestaat uit een dubbelstrengs DNA-kerngebied (dsDNA) met enkelstrengs DNA (ssDNA) overhangen, die gereseceerde DNA-uiteinden nabootsen9. Vier nucleotide-microhomologieën aan de uiteinden van de ssDNA-regio's coderen voor het startcodon voor het reporter-gen. Reparatie van dit substraat door middel van MMEJ herstelt het open leesraam van het reportergen (ORF).
Resectie-afhankelijke MMEJ: Het N-terminale reporter-gen exon wordt onderbroken door een segment met een stopcodon, dat wordt geflankeerd door 8 basenpaar (bp) microhomologieën. Nucleolytische eindresectie is vereist voorafgaand aan MMEJ-gemedieerd herstel om het intacte reporter-gen te herstellen.
Botte NHEJ: Het reporter-gen is opgesplitst in N- en C-terminale secties, waarvan de laatste stroomopwaarts van de promotor wordt geplaatst. De DSB wordt geproduceerd met behulp van EcoRV en vereist directe ligatie (zonder eindverwerking) door NHEJ om beide delen van het reportergen opnieuw te verbinden en de reporter ORF te herstellen.
Niet-botte NHEJ: De DSB bevindt zich in een intron en zal cohesieve of niet-cohesieve uiteinden hebben, afhankelijk van de keuze van het restrictie-enzym. De reparatie van dit substraat door NHEJ vereist ligatie die wordt voorafgegaan door eindverwerking.
Lange sjabloon HR: Het N-terminale exon van het reporter-gen wordt onderbroken door een DNA-segment dat restrictieplaatsen bevat, die 22 bp van de oorspronkelijke reporter-gensequentie vervangen. Om deze sequentie te herstellen, maakt reparatie door HR gebruik van het homologiesjabloon van 2,5 kilobase (kb) dat stroomafwaarts van het C-terminale exon is geplaatst.
Kort sjabloon HR: De beperkingsplaats die nodig is om de DSB te genereren, vervangt een deel van de oorspronkelijke reporter-gensequentie en introduceert een in-frame stopcodon. Net als de versie met lange sjablonen, vereist dit HR-substraat de stroomafwaartse homologiesjabloon (360 bp) voor nauwkeurige reparatie en restauratie van de reporter ORF.
SSA: Dit substraat bevat een voortijdig stopcodon dat zich in het N-terminale exon van het reporter-gen bevindt. De verwijdering van dit stopcodon en het herstel van de intacte reporter-gensequentie vereist reparatie door SSA, wat bidirectionele resectie op lange afstand inhoudt voorafgaand aan de uitlijning van de homologieën.
Voor het genereren van de DSB kan een deel van de reportersubstraten worden vergist met I-SceI (Figuur 1). Dit genereert een lineair substraat met niet-samenhangende uiteinden in de resectie-afhankelijke MMEJ, niet-botte NHEJ, lange sjabloon HR- en SSA-reporters, die tandem I-Sce I-sitesin omgekeerde oriëntaties hebben. In het korte sjabloon HR-reportersubstraat zal de vergisting van de enkele I-Sce I-sitesamenhangende uiteinden genereren. De niet-botte NHEJ, resectie-afhankelijke MMEJ, lange sjabloon HR en SSA-plasmiden kunnen ook worden verteerd met HindIII, dat complementaire cohesieve uiteinden zal produceren.
We bieden protocollen voor het genereren van de reporter-assaysubstraten en beschrijven hoe de assays kunnen worden uitgevoerd, waarbij we details geven over hoe ze kunnen worden gebruikt om DSBR te kwantificeren, inclusief titreerbare reacties op kleine moleculen, het beoordelen van cellulaire potentie, activiteit op het doel en pathway-selectiviteit.

<table><tbody><tr><td>10x TBE buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% TBE-acrylamide gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Gel Loading Dye, Purple</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>96-well white plate (with transparent bottom and lid)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Voor parelgebaseerde zuivering van DNA</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase en 10X buffer</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>Plate reader</td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Celteller</td></tr><tr><td>Aangepaste oligonucleotiden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Aangepaste bestelling</td><td>Voor resectie-onafhankelijk MMEJ-substraat. Zie tabel 2.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>DMSO-gebaseerde verbinding dispenser</td></tr><tr><td>D300e D4+ cassette</td><td>Tecan</td><td>30097371</td><td>Grote volume cassette voor D300e verbinding dispenser</td></tr><tr><td>D300e T8+ cassette</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>Kleine volume cassette voor D300e verbinding dispenser</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, celkweekkwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Drager voor verbindingen, gebruikt in figuur 4 en figuur 5</td></tr><tr><td>DSBR reporter bron plasmiden</td><td>Artios</td><td></td><td>Beschikbaar voor de academische gemeenschap op aanvraag&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF en 10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>DNA ladder met laag molecuulgewicht</td></tr><tr><td>HEK-293 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Voorbeeld cel lijn gebruikt in protocol</td></tr><tr><td>HindIII-HF en 10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone moleculaire biologie kwaliteit water</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI en 10x Tango Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME reagens en buffer</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Lipide-gebaseerde transfectie reagens</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Centrifuge voor 15 of 50 mL buizen</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>Kweekmedium voor HEK-293 cellen</td></tr><tr><td>Microplate shaker</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Microplate orbital shaker</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Centrifuge voor 1.5 of 2 mL buizen</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Cel of water-gebaseerde reagens dispenser</td></tr><tr><td>MultiDrop Standard Cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>24072670</td><td>Cassette voor MultiDrop reagens dispenser</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop &amp; Glo Buffer en Substraat</td><td>Promega</td><td>N1630 of N1650</td><td>Reporter luciferase (NanoLuc) reagens om Firefly luminiscentie te dempen en NanoLuc luminiscentie te detecteren. Onderdeel van de Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit</td></tr><tr><td>ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer en Substraat</td><td>Promega</td><td>N1630 of N1650</td><td>Controle luciferase (Firefly) assay reagens om Firefly te detecteren. Onderdeel van de Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit</td></tr><tr><td>PBS (zonder calcium of magnesium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Firefly plasmid (of vergelijkbaar)</td><td>Promega</td><td>E1310 (of equivalent)</td><td>Firefly controle plasmid</td></tr><tr><td>pNL1.1 NanoLuc plasmid (of vergelijkbaar)</td><td>Promega</td><td>N1091 (of equivalent)</td><td>NanoLuc controle plasmid, voor aanpassing van apparaat instellingen/optimalisatie experimenten</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>DNA ladder met hoog molecuulgewicht</td></tr><tr><td>Natrium Acetaat (3 M), pH 5.5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Voor pH aanpassing tijdens gel extractie met QIAquick Gel Extraction Kit</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Voor visualisatie van ssDNA en dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Voor visualisatie van alleen dsDNA</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase en 10x Ligase buffer</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw kleurstof 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Voor meting van levensvatbaarheid tijdens celtelling</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA oplossing; 0,25% Trypsin en 0,53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI en 10x CutSmart buffer</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van de reparatieactiviteit van dna-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

Het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) is cruciaal voor het behoud van de stabiliteit van het genoom en de levensvatbaarheid van de cel. DSB-reparatie (DSBR) in cellen wordt gemedieerd via verschillende mechanismen: homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ), microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ) en enkelstrengs gloeien (SSA). Cellulaire assays zijn essentieel om de vaardigheid en modulatie van deze routes te meten als reactie op verschillende stimuli.
Hier presenteren we een reeks extrachromosomale reporter-assays die elk de reconstitutie van een nanoluciferase-reporter-gen meten door een van de vier belangrijkste DSBR-routes in cellen. Bij voorbijgaande transfectie in cellen van belang, kan reparatie van pathway-specifieke reportersubstraten in minder dan 24 uur worden gemeten door de detectie van Nanoluciferase (NanoLuc) luminescentie.
Deze robuuste testen zijn kwantitatief, gevoelig, titreerbaar en vatbaar voor een high-throughput screeningformaat. Deze eigenschappen bieden brede toepassingen in DNA-reparatieonderzoek en het ontdekken van geneesmiddelen, als aanvulling op de momenteel beschikbare toolkit van cellulaire DSBR-assays.

Reparatie van elk van de reporter-assays kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van dezelfde procedure. Correcte reparatie van een substraat door zijn verwante reparatieroute in cellen zal een intacte, functionele ORF-codering NanoLuc reconstrueren. Dit luminescentiesignaal kan worden gedetecteerd met behulp van een plaatlezer.
De co-transfectie met een intact plasmide dat codeert voor Firefly-luciferase dient als transfectiecontrole. Deze controle dient twee doelen. Ten eerste biedt het een standaard om het NanoLuc-signaal naar te normaliseren, aangezien het ongestoord moet zijn door modulatie van DSBR met genetische of farmacologische middelen. Ten tweede kan het een indicatie geven van off-target cellulaire verstoringen die het luciferasesignaal beïnvloeden, zoals modulatie van de celcyclus, effecten op transcriptie/translatie of algemene toxiciteit.
De verhouding tussen NanoLuc en Firefly dient als een surrogaatuitlezing van reparatie. Luminescentiewaarden kunnen worden geëxporteerd en geanalyseerd door de twee luciferasesignalen vanuit dezelfde put te normaliseren. In het geval van genetische verstoringsstudies (bijv. het vergelijken van wildtype en KO of niet-targeting- en doelsiRNA), wordt reparatie meestal genormaliseerd naar het ouderlijke monster (wildtypecellen of cellen behandeld met niet-targeting-controle-siRNA). In het geval van farmacologische modulatie worden de waarden van een met een verbinding behandeld monster genormaliseerd naar de waarde die wordt geproduceerd door de behandeling met het medium.
De volledige validatie van de beschreven reporter suite is onlangs gepubliceerd7. Gegevens die de karakterisering van de genetische en farmacologische modulatie van DSBR illustreren, worden weergegeven in figuur 4 (aangepast van 7). Polθ is de belangrijkste mediator van MMEJ en er wordt voorspeld dat verlies of remming van dit enzym specifiek cellulair MMEJ zal ablateren 3,10. Met behulp van een cellijn waarin POLQ, het gen dat codeert voor Polθ, is uitgeschakeld11, toont de resectie-onafhankelijke MMEJ-reportertest aan dat MMEJ inderdaad bijna volledig onderdrukt is. Evaluatie van de component NanoLuc- en Firefly-luminescentiesignalen toont aan dat het waargenomen reparatiedefect wordt aangedreven door een vermindering van het NanoLuc-signaal (gecodeerd door het reportersubstraat) terwijl het Firefly-signaal (controle) ongestoord is (Figuur 4A-C). Daarentegen toont de beoordeling van NHEJ-vaardigheid met behulp van de NHEJ-reporter met stomp uiteinde aan dat POLQ-knock-out de reparatie van het reportersubstraat niet belemmert (Figuur 4D-F). Samen ondersteunen deze genetische gegevens de specifieke rol van Polθ bij MMEJ-gemedieerd herstel. Deze waarnemingen zijn farmacologisch volledig gerecapituleerd met ART558 12,13, een recent gerapporteerde zeer krachtige en specifieke remmer van het polymerasedomein van Polθ (Figuur 4G), waar titreerbare remming van MMEJ wordt waargenomen, die voortkomt uit een specifieke afname van het NanoLuc-signaal en niet van het Firefly-signaal (Figuur 4H). Bovendien, en in overeenstemming met genetische gegevens, is er geen effect op NHEJ (Figuur 4I,J). Samen benadrukken deze gegevens hoe deze reporters kunnen worden gebruikt om de genetische modulatie van DSBR-routes te karakteriseren en cellulaire potentie en doel-/routespecificiteit van kleine moleculen aan te tonen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Figuur 4: Effecten van genetische knock-out en farmacologische remming van Polθ op MMEJ- en NHEJ-reportersignalen. eHAP1 WT- en POLQ(-)- cellen werden getransfecteerd met een Firefly-controleplasmide en met (A-C) de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter of (DF) blunt end NHEJ-reporter. Het percentage MMEJ- of NHEJ-reparatie is de verhouding tussen NanoLuc-luminescentie en Firefly-luminescentie, genormaliseerd naar de DMSO-behandelde controlegroep, 24 uur na transfectie. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van drie biologische replicaten, elk gemiddeld 8 technische replicaten. HEK-293-cellen werden getransfecteerd met een Firefly-controleplasmide en (G,H) de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter of de (I,J) blunt end NHEJ-reporter en behandeld met de Polθ-polymeraseremmer ART558. Het reparatiepercentage is de verhouding tussen NanoLuc-luminescentie en Firefly-luminescentie, genormaliseerd naar de met DMSO behandelde controle, 24 uur na transfectie. De procentuele remming van de individuele luminescentiesignalen in (G) en (I) werd berekend ten opzichte van de met DMSO behandelde controlegroep en weergegeven in respectievelijk (H) en (J). De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 2 biologische replicaten, elk gemiddeld 4 technische replicaten. Deze figuur is een bewerking van Rajendra et al.7. Afkortingen: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; WT = wild type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Figuur 5: Remming van het HR-reportersignaal door de RAD51-remmer CAM833. (A) HEK-293-cellen werden getransfecteerd met het HR-reportersubstraat met lange sjabloon, een Firefly-luciferasecontroleplasmide en behandeld met de RAD51-remmer CAM83314. De luminescentie van NanoLuc en Firefly werd 16 uur na transfectie afgelezen. Het percentage HR-reparatie is de verhouding tussen NanoLuc-luminescentie en Firefly-luminescentie, genormaliseerd naar de met DMSO behandelde controlegroep. Stippellijnen markeren het percentage HR-remming en CAM833-concentratie bij de curve EC50. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 2 biologische replicaten, elk gemiddeld 4 technische replicaten. (B) De procentuele remming van de individuele luminescentiesignalen in (A) werd berekend ten opzichte van de met DMSO behandelde controlegroep. Stippellijnen markeren het percentage NanoLuc- en Firefly-remming op 3,33 μM CAM833 (EC50). De afname van het Firefly-signaal bij CAM833-concentraties ≥ 10 μM is een indicatie van samengestelde toxiciteit bij hoge doses; NanoLuc-signaalvermindering wordt echter waargenomen bij concentraties waarbij het Firefly-signaal niet wordt beïnvloed, wat suggereert dat CAM833 on-target HR-remming induceert. Deze figuur is een bewerking van Rajendra et al.7. Afkortingen: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = homologe recombinatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Reporter substraat</td>
			<td>Bron: plasmide (grootte in kb, weerstand)</td>
			<td colspan="3">DSB-generatie</td>
			<td>Verwachte grootte van het substraat van de eindreporter (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Resectie-onafhankelijke MMEJ</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Weggesneden 3' staarten door ligatie van doppen</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Resectie-afhankelijke MMEJ</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Botte NHEJ</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Blunt eindigt bij excisie van plasmide door EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Niet-botte NHEJ</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Lange sjabloon HR</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Kort sjabloon HR</td>
			<td>9.3, Ampère</td>
			<td colspan="3">I-SceI (samenhangend)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Reporter substraat plasmiden. Afkortingen: DSB = double strand break; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; HR = homologe recombinatie; SSA = enkelstrengs gloeien; Kan = kanamycine; Ampère = ampicilline.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Opeenvolging (5'-3')</td>
			<td>Leverancier</td>
			<td>Zuivering</td>
			<td>Functie</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BLADZIJDE</td>
			<td>Linker kap, lang oligonucleotide</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BLADZIJDE</td>
			<td>Linker kap, kort oligonucleotide</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5" AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BLADZIJDE</td>
			<td>Rechterkap, lang oligonucleotide</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5" [Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BLADZIJDE</td>
			<td>Rechterkap, korte oligonucleotide</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Oligonucleotiden voor caps voor het genereren van resectie-onafhankelijk MMEJ-reportersubstraat. Afkortingen: ssDNA = enkelstrengs DNA; dsDNA = dubbelstrengs DNA; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; PAGE = elektroforese van polyacrylamidegel. Microhomologieën worden onderstreept.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reporter test</td>
			<td>NanoLuc reporter substraat DNA (μg DNA/1x106 cellen)</td>
			<td>Firefly controle luciferase plasmide (μg DNA/1x106 cellen)</td>
		</tr><tr><td>Resectie-onafhankelijke MMEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Resectie-afhankelijke MMEJ</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Botte NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Niet-botte NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Lange sjabloon HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Kort sjabloon HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: DNA-hoeveelheden voor voorbijgaande transfectie van NanoLuc-reportersubstraten en Firefly-controleluciferaseplasmide (HEK-293, plaatformaat met 96 putjes). Afkortingen: MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; HR = homologe recombinatie; SSA = enkelstrengs gloeien.

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

assessment-dna-double-strand-break-repair-activity-using-high

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Het doel van dit protocol is te kwantificeren van het herstel van gedefinieerde DNA-proteïne crosslinks op plasmide DNA. Lesioned plasmiden zijn transfected in ontvangende zoogdieren cellijnen en laag-moleculair gewicht geoogst op meerdere tijd punten na transfectie. DNA repair kinetiek worden gekwantificeerd aan de hand van strand-specifieke primer uitbreiding gevolgd door qPCR.

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

Dit protocol presenteert een nieuw reporter-gensysteem en de experimentele opstelling om transcriptie te detecteren bij DNA-dubbelstrengsbreuken met gevoeligheid van één molecuul.

Live-Cell Imaging van transcriptionele activiteit bij DNA Double-Strand Breaks

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Hier presenteren we de preklinische screening van antikanker coumarinen met behulp van 3D-cultuur en zebravissen.

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

Leer hoe je DNA-dubbelstrengsbreukreparatie meet met luminescentie-gebaseerde reporter-assays. Deze methoden ondersteunen oncologisch onderzoek en versnellen de identificatie van nieuwe medicijndoelen.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Meer video's verkennen