Eiwittechniek door gist Surface Display

In mijn lab ontwikkelen we cellulaire therapieën van de volgende generatie door eiwittechnologie te combineren met cellulaire engineering. Dus ontwikkelen we eiwitcomponenten om nieuwe functies te verkrijgen of bestaande functies te verbeteren, en nemen we deze nul-eiwitten vervolgens op in cellulaire therapieën. We hebben het gebruik van oppervlaktedisplays verder ontwikkeld voor gespecialiseerde toepassingen, waaronder eiwitstabiliteitsengineering, engineering van door kleine moleculen gereguleerde eiwitschakelaars en specifieke targeting van kankergeassocieerde geactiveerde receptorbevestigingen.

Het voordeel van het weergeven van gistoppervlakken in vergelijking met andere weergavetechnologieën zoals faag- of ribosoomweergave, is de flowcytometrische visualisatie van de bibliotheek tijdens het sorteerproces en de nauwkeurige controle van de selectievoorwaarden, zoals antigeenconcentratie en strengheid van de sorteerpoort. Bereid om te beginnen de kralen voor op de eerste kralenselectie door 10 microliter magnetische kralen van het biotinebindmiddel opnieuw te suspenderen in 990 microliter PBSA. Voor het wassen plaatst u de tube twee minuten op een magnetisch rek met het deksel open.

Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant. Resuspendeer de gewassen kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter in één milliliter PBSA met 6,7 tot 33 picomol gebiotinyleerd antigeen. Plaats de buis na incubatie twee minuten op een magnetisch rek met het deksel open, verwijder het bovenstaande en was de met antigeen beladen kralen met één milliliter PBSA.

Zodra de kralen zijn neergedaald, verwijdert u de PBSA. suspendeer vervolgens de met antigeen beladen kralen opnieuw in 50 microliter PBSA. Bereid de cellen, antigeenkorrels en een oplossing van berenkralen voor op negatieve selecties.

Resuspendeer na het wassen de antigeenkorrels in 50 microliter PBSA en suspendeer de berenkorrels in 150 microliter PBSA. Voeg voor de eerste negatieve selectie 50 microliter gewassen kale kralen toe aan 950 microliter gewassen cellen in PBSA en incubeer het mengsel gedurende 1,5 uur bij vier graden Celsius. Plaats na de incubatie de buisjes met de berenparelcelsuspensies op een magnetisch rek met het deksel open.

Spuit de vloeistof in het deksel in de tube en wacht twee minuten. Breng vervolgens de ongebonden cellen over naar een verse microcentrifugebuis en voeg 50 microliter gewassen berenkralen toe. Voeg na drie rondes van negatieve selectie 50 microliter antigeen-geladen kralenoplossing toe aan de cellen.

Incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Plaats nu de cellen met de met antigeen beladen kralen op een magnetisch rek met het deksel open. Spuit alle vloeistof die in het deksel zit in de buis.

Wacht twee minuten voordat u niet-gebonden cellen weggooit. Voer alle resterende stappen uit zoals beschreven voor de eerste selectie van de antigeenkorrel. Na drie negatieve en één positieve selectie, suspendeer de cellen snel in één milliliter SDCAA en breng ze over naar een schudkolf met een groter volume SDCAA.

Na een nachtelijke inductie van oppervlakte-expressie van eiwitten in SGCAA in gistbibliotheken, pellet je genoeg cellen om 10 keer de diversiteit te bedekken en gooi je het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in PBSA en breng deze over in microcentrifugebuisjes. Gebruik 30 miljoen cellen voor kleuring in elk buisje.

Bereid zoveel buisjes voor als nodig is op basis van de diversiteit, inclusief één controlebuisje zonder het antigeen. Centrifugeer de buisjes vervolgens vijf minuten op 2000 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 200 microliter PBSA met het antigeen en incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius.

Nadat u de centrifugatie opnieuw hebt uitgevoerd, verwijdert u PBSA uit de pellet. Resuspendeer vervolgens de cellen in 100 microliter koude PBSA met antilichamen voor displaykleuring en antigeendetectie. Incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Na de incubatie centrifugeren de cellen bij 2000 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Voeg een milliliter PBSA toe aan de pellet en herhaal de centrifugatie. Verwijder vervolgens het grootste deel van het supernatant en laat slechts 20 tot 30 microliter over om te voorkomen dat de pellet uitdroogt.

Resuspendeer de korrel in koude PBSA vlak voor het sorteren. Sorteer de cellen nu rechtstreeks in SDCAA, een medium. Breng de cellen na het sorteren over naar een schudkolf met een groter volume SDCAA-medium en incubeer bij 30 graden Celsius met schudden bij 180 RPM.