Name: Zebra II als een nieuw systeem om elektrofysiologische signalen bij zebravissen op te nemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer het Zebra II-systeem voor langdurige ECG-registratie bij zebravissen met meerkanaals elektroden. Deze methode maakt tot een uur opname mogelijk voor cardiaal onderzoek en geneesmiddelscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de steun van de NIH SBIR Phase II #R44OD024874 aan H.C. en M.P.H.L. De auteurs willen ook de financiële steun bedanken die is verstrekt door de Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) in Mexico via de beurs genaamd Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.

Strikt volgens de ethische richtlijnen zorgen voor het welzijn en de juiste behandeling van de zebravissen die betrokken zijn bij onze experimenten. Alle experimentele activiteiten werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen vastgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC). De experimenten en bevindingen die hier worden beschreven, werden uitgevoerd met de goedkeuring van IACUC onder het geautoriseerde protocol AUP-21-066.
1. Voorbereiding en opslag van stamoplossingen
VOORSICHT: Bereid de tricaine stamoplossing voor in een afzuigkap en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
<ol>
	<li>Meet 400 mg tricainepoeder af en los het op in 97,9 mL gedeïoniseerd (DI) water. Plaats een magnetische roerder in de container en meng de oplossing geleidelijk.</li>
	<li>Pas de pH aan door incrementeel minder dan 17 mL NaOH-oplossing toe te voegen. Blijf NaOH druppels toevoegen tot de pH een bereik van 6,8.-7,2 bereikt.</li>
	<li>Bepaal de uiteindelijke concentratie van tricaine-oplossing, rekening houdend met de toegevoegde NaOH die nodig is om de pH aan te passen en op te slaan. 
	OPMERKING: Tricaine-oplossing is lichtgevoelig en moet worden bewaard in een amberkleurig container bij 4 °C wanneer het niet in gebruik is.</li>
	<li>Meet 258,13 mg Amiodarone af en los het op in 1 L DI water. Plaats een magnetische roerder in de container en roer een paar minuten totdat de oplossing volledig is opgelost en vrij is van elk poeder. Bewaar de oplossing in een koelkast bij 4°C wanneer het niet in gebruik is. 
	OPMERKING: Amiodarone moet worden bereid in een afzuigkap en opgeslagen in een koelkast bij 4 °C. Draag altijd de juiste PBM.</li>
</ol>
2. Vishouderij
<ol>
	<li>Houd de vissen in individuele tanks die zijn verbonden met een circu-lerend watersysteem, waarbij de temperatuur tussen de 28-29°C wordt gehouden.</li>
	<li>Zorg voor continue monitoring van de waterkwaliteit en houd u aan een cyclus van 14 uur dag/10 uur nacht.</li>
	<li>Verdeel de 40 vissen in vier groepen, elk bestaande uit 10 vissen, en huisvest ze in aparte tanks.</li>
</ol>
3. Instellen van het apparaat
OPMERKING: De procedure die in stap 3.2 wordt beschreven, moet worden uitgevoerd voor elke kamer van het apparaat (Figuur 1). Hoewel elke kamer anders kan worden ingesteld, is het voor consistentie in het experiment raadzaam om uniforme instellingen over alle kamers te handhaven.
<ol>
	<li>Verbind het apparaat met een stroombron en start de werking door op de Rode Knop op het voorpaneel te drukken.</li>
	<li>Navigeer via het touchscreen van het apparaat om de te configureren kamer te kiezen.
	<ol>
		<li>Stel de instelling van de laagdoorlaatfilter in op 0,1 Hz en de instelling van de hoogdoorlaatfilter in op 500 Hz. Pas de versterkingsinstelling aan naar 10.000.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Til de voorklep op om toegang te krijgen tot de vier kamers. Voordat u het experiment start, dompelt u de spons (standaard cellulosespons) van elke kamer onder in tricaine-oplossing en perst u eventueel overtollig vocht eruit.</li>
	<li>Draai de vier-elektroden array zodat de spons toegankelijk is voordat u de vissen introduceert.</li>
</ol>
4. Amiodarone behandeling
OPMERKING: Gebruik het water uit de vistanks (viswater) om verdunde oplossingen van Amiodarone en Tricaine te bereiden. Stappen 4.3 en 4.4 moeten worden herhaald voor elke groep die in stap 2.3 is gescheiden voor elke oplossing die in stap 4.1 is bereid.
<ol>
	<li>Volg de onderstaande stappen om de Amiodarone stamoplossing te verdunnen.
	<ol>
		<li>Verdun 8,75 mL stamoplossing in 41,25 mL viswater om een concentratie van 70 µM te bereiken.</li>
		<li>Verdun 12,5 mL stamoplossing in 37,5 mL viswater om een concentratie van 100 µM te bereiken.</li>
		<li>Verdun 25 mL stamoplossing in 25 mL viswater om een concentratie van 200 µM te bereiken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid de anesthesieoplossing voor door 4 mL tricaine stamoplossing te verdunnen in 100 mL viswater, resulterend in een tricaineconcentratie van 0,16 mg/mL</li>
	<li>Dompel elke vis individueel gedurende 5 minuten in de bereide Amiodarone-oplossing. Gebruik timers om de onderdompelingsduur nauwkeurig te bewaken.</li>
	<li>Breng de vis over in tricaineoplossing gedurende 2-3 minuten voor anesthesie. Zorg ervoor dat de behandeling de dood van de vis niet veroorzaakt. Als een vis abnormaal gedrag vertoont, zoals kleurverlies of een significante vermindering van kieuwbeweging, verwijder deze onmiddellijk uit de oplossing en plaats hem terug in schoon viswater.</li>
</ol>
5. ECG gegevensverzameling
OPMERKING: Volg onmiddellijk deze instructies na het voltooien van stap 4.4. Herhaal het proces voor elke kamer voordat u het apparaat afsluit. De kamers zijn ontworpen om vissen te huisvesten met een breedte van 4-10 mm en een lengte van 25-50 mm.
<ol>
	<li>Til de vis uit de tricaineoplossing en plaats hem op de spons, ervoor zorgen dat de buikzijde naar boven wijst.</li>
	<li>Plaats de elektrodenarray in een ruitvorm over de borststreek van de vis om ECG-signalen vanuit vier verschillende punten gelijktijdig te vangen (Figuur 2A,B). Zorg ervoor dat u elke elektrode zorg

Zebra II: Advanced ECG System for Multichannel Zebrafish Cardiovascular Studies

<ol><li>Tsao, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2022+update%3A+A+report+from+the+American+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2022 update: A report from the American heart association.</a> Circulation. 145 (8), e153-e639 (2022).</li>
<li>Zulkifly, H., Lip, G. Y. H., Lane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of atrial fibrillation.</a> Int J Clin Pract. 72 (3), e13070(2018).</li>
<li>Ferreira, C., Providência, R., Ferreira, M. J., Gonçalves, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+and+non-cardiovascular+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Arq+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation and non-cardiovascular diseases: A systematic review.</a> Arq Bras Cardiol. 105 (5), 519-526 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Ding, L., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation%3A+mechanism+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation: mechanism and clinical management.</a> Chin Med J. 136 (22), 2668-2676 (2023).</li>
<li>Babapoor-Farrokhran, S., Rasekhi, R. T., Gill, D., Babapoor, S., Amanullah, A. Arrhythmia in COVID-19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBabapoor-Farrokhran%2C+S+%22SN+Comp+Clin+Med%22">SN Comp Clin Med</a>. 2 (9), 1430-1435 (2020).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Koopman, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+grime+mutant+uncovers+an+evolutionarily+conserved+role+for+Tmem161b+in+the+control+of+cardiac+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish grime mutant uncovers an evolutionarily conserved role for Tmem161b in the control of cardiac rhythm.</a> Proc Natl Acad Sci. 118 (9), e2018220118(2021).</li>
<li>Genge, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGenge%2C+CE+%22Reviews+of+Physiology%2C+Biochemistry+and+Pharmacology%22">Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology</a>. , Springer International Publishing. (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-electrocardiograms+to+study+post-ventricular+amputation+of+Zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Engg%22%5BJournal%5D)">Micro-electrocardiograms to study post-ventricular amputation of Zebrafish heart.</a> Ann Biomed Engg. 37 (5), 890-901 (2009).</li>
<li>Lin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+and+economic+in+vivo+electrocardiogram+platform+for+cardiovascular+drug+assay+and+electrophysiology+research+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish.</a> Sci Rep. 8 (1), 15986(2018).</li>
<li>Chaudhari, G. H., Chennubhotla, K. S., Chatti, K., Kulkarni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+adult+zebrafish+ECG+method+for+assessment+of+drug-induced+QTc+prolongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of the adult zebrafish ECG method for assessment of drug-induced QTc prolongation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 67 (2), 115-120 (2013).</li>
<li>Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+surface+ECG+recording+in+adult+zebrafish+reveals+that+the+value+of+this+model+exceeds+our+expectation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation.</a> Sci Rep. 6, 25073(2016).</li>
<li>Stoyek, M. R., Rog-Zielinska, E. A., Quinn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+electrical+function+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in electrical function of the zebrafish heart.</a> Prog Biophys Mol Biol. 138, 91-104 (2018).</li>
<li>Cao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wearable+multi-channel+microelectrode+membranes+for+elucidating+electrophysiological+phenotypes+of+injured+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Integ+Biol%22%5BJournal%5D)">Wearable multi-channel microelectrode membranes for elucidating electrophysiological phenotypes of injured myocardium.</a> Integ Biol. 6 (8), 789-795 (2014).</li>
<li>Lenning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+analysis+of+zebrafish+electrocardiogram+with+anomaly+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and analysis of zebrafish electrocardiogram with anomaly detection.</a> Sensors. 18 (1), 61(2018).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+microelectrode+arrays+to+interface+epicardial+electrical+signals+with+intracardial+calcium+transients+in+zebrafish+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdev%22%5BJournal%5D)">Flexible microelectrode arrays to interface epicardial electrical signals with intracardial calcium transients in zebrafish hearts.</a> Biomed Microdev. 14 (2), 357-366 (2012).</li>
<li>Cho, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+animal+model+in+epilepsy+studies+with+multichannel+EEG+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an animal model in epilepsy studies with multichannel EEG recordings.</a> Sci Rep. 7 (1), 3099(2017).</li>
<li>Continuous electrocardiogram monitoring in Zebrafish with prolonged mild anesthesia. Le, T., et al. 42nd Ann Int Conf IEEE Engg Med Biol Soc, , 2610-2613 (2020).</li>
<li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+wireless+ECG+system+for+prolonged+monitoring+of+multiple+zebrafish+for+heart+disease+and+drug+screening+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A novel wireless ECG system for prolonged monitoring of multiple zebrafish for heart disease and drug screening studies.</a> Biosensors Bioelectron. 197, 113808(2022).</li>
<li>Kouzehgar, K., Eslamian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2+-+Application+of+experimental+data+and+soft+computing+techniques+in+determining+the+outflow+and+breach+characteristics+in+embankments+and+landslide+dams%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+Hydroinfo%22%5BJournal%5D)">Chapter 2 - Application of experimental data and soft computing techniques in determining the outflow and breach characteristics in embankments and landslide dams.</a> Handbook Hydroinfo. 3, 11-31 (2023).</li>
<li>Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+of+adult+zebrafish+electrocardiogram+and+assessment+of+drug-induced+QT+prolongation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (1), H269-H273 (2006).</li>
</ol>

Hung Cao en Michael Lau zijn de oprichters van Sensoriis, Inc. Het systeem Zebra II van Sensoriis is ontwikkeld met ondersteuning van de NIH, SBIR Phase II grant #R44OD024874. De Universiteit van Californië, Irvine, heeft de relatie van Hung Cao met Sensoriis, Inc. beoordeeld en goedgekeurd in overeenstemming met haar beleid inzake belangenverstrengeling. De andere auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

De huidige stappen werden aangepast en verbeterd volgens deze nieuwe apparaatversie van een eerder onderzoek door ons team20. Hierbij is ook een gelabelde computer-aided design (CAD) van het apparaat opgenomen.
Zoals gemarkeerd in de probleemoplossingsgids van het protocol, vereist het apparaat dat de gebruiker bepaalde cruciale stappen met zorgvuldigheid en precisie uitvoert, aangezien deze stappen van cruciaal belang zijn voor de kwaliteit van het ECG-signaal. In overeenstemming met de bevindingen van ons eerdere onderzoek20, speelt de positionering van de elektroden een belangrijke rol bij het verkrijgen van hoogwaardige en duidelijke ECG-metingen van zebravismonsters. Doordat deze methode het aantal werkende elektroden van één naar vier uitbreidt en extra vrijheidsgraden introduceert, vereist het aanvullende probleemoplossingsstappen en verfijnde elektrodepositie over het ventrale gebied van de vis voor optimale resultaten.
De voordelen en nieuwe kenmerken van het apparaat liggen in de uitgebreide meting voor multi-stap experimenten, beperkt tot studies van een uur, hoogdoorlaatscreening met meerdere zebravissen (vier gelijktijdige studies), een sterk beheersbare experimentele opstelling, aanvullende elektrofysiologische opnames per monster (tot vier) en geautomatiseerde cloud-gebaseerde analyse en gegevensopslag. Hieruit willen we benadrukken dat het belangrijkste probleem dat wordt aangepakt, de tijd is die nodig is om medicijnscreening en cardiale studies bij zebravissen uit te voeren, omdat traditionele methoden een één-op-één screening en meerdere pogingen vereisen om voldoende informatie te verzamelen22. Dit biedt ook een nieuwe manier om multi-kanaals arrays te gebruiken om ECG op een eenvoudiger manier op te nemen in vergelijking met die welke micro-elektrode arrays (MEA) of flexibele bedrukte printplaten (FPCB)18 gebruiken, die extra stappen vereisen bij de fabricage van de genoemde elektroden plus de procedure die nodig is om ze aan de vis te bevestigen in vergelijking met de voorgestelde methode die ook op oppervlaktecontact berust, maar op een minder invasieve manier.
De beperkingen van het systeem verschillen niet van die welke gepresenteerd worden in traditionele methoden19,20, maar zijn minder intensief aangezien een multi-kanaals array wordt gebruikt om het aantal opnamepogingen voor het onderzoek te verminderen. Deze beperkingen zijn afhankelijk van de elektrodepositie, aangezien het wordt aanbevolen om de voorgestelde positie te volgen die wordt gepresenteerd in Figuur 2B. Het moet ook duidelijk zijn dat de gebruiker niet mag verwachten perfecte opnamen te hebben tijdens de eerste poging op de vier kanalen, aangezien de anatomische verschillen van vissen en de voorverwerking van het monster (ont-schalen, open-borst procedures, enz.) direct de kwaliteit en het succes van de tests zullen beïnvloeden.

Hart- en vaatziekten (CVZ) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Volgens het AHA-updaterapport van 2024 sterven er dagelijks ongeveer 2552 mensen aan CVZ in de VS, en de gemiddelde directe en indirecte kosten van CVZ werden geschat op $378,0 miljard in 2017-20181. Atriumfibrilleren (AF) is een van de meest voorkomende hartritmestoornissen in de VS2 en wordt geassocieerd met een ongunstige prognose, waardoor het risico op een beroerte en overlijden in zowel CVZ- als niet-hart- en vaatziektenscenario's toeneemt, wat leidt tot een verhoogd risico op nadelige uitkomsten3. Dit type hartritmestoornis onderscheidt zich door snelle en onregelmatige elektrische activiteit in de atria, wat meestal resulteert in een snelle en onregelmatige ventriculaire ritme4. Verder is er, gezien de recente gebeurtenissen rondom COVID-19, een toename van studies en bewijs dat een verhoogde verschijning van hartritmestoornissen in verband met COVID-19 laat zien, meestal sinusbradycardie5. Aan de andere kant van AF presenteert sinusbradycardie een verlaagde en langzamere hartslag, met een hartslag lager dan 60 slagen per minuut (bpm). Voor deze diagnose is een elektrocardiogram (ECG) vereist dat een normale sinusritme toont bij een snelheid lager dan 60 bpm.
De zebravis, Danio rerio, heeft zich bewezen als een ideaal model voor onderzoek naar hart- en vaatziekten en voor het ontwikkelen van medicijnen vanwege zijn homologie met de mens in zowel morfologie, fysiologie als genetica6,7. Ondanks dat de zebravis slechts twee onderscheidbare kamers heeft in vergelijking met de vierkamerige hart bij de mens, bezit de zebravis een vergelijkbare contractiele structuur met een analoog geleidingssysteem8,9. Daarom is het zebravismodel geschikt voor het onderzoeken van hartritmestoornissen en het onderzoeken van de associatie tussen gerelateerde genetische paden en elektrofysiologische kenmerken door ECG-analyse. Wat betreft het sensorontwerp voor ECG-opname bij zebravissen, worden conventionele naaldelektroden vaak gebruikt10. Andere onderzoeken presenteerden alternatieven voor conventionele naalden door een ander type naald te ontwerpen gemaakt van verschillende materialen11, deze bevatten materialen zoals wolfraamfilament, roestvrij staal en zilverdraad om de kwaliteit van de geregistreerde gegevens te beoordelen. Samen met de draagbare ECG-kit, probeerden ze een universele platform te vestigen voor zowel onderzoeks- als educatieve laboratoria.
Het naaldsysteem werd ook in andere onderzoeken ingezet11,12,13,14 voor het uitvoeren van onderzoek naar biologische en/of door geneesmiddelen geïnduceerde effecten, waarbij het bemoedigende resultaten toonde. Om optimale signalen te verkrijgen, was het echter noodzakelijk om de naalden zorgvuldig door de dermis van de zebravis te steken. Deze invasieve procedure kan schade veroorzaken aan het hart van de vis vanwege de scherpte van de naalden, waardoor mogelijk de signaalmorfologie verandert13. Bovendien stelt het nauwkeurig plaatsen van de elektrode op het kleine hart zonder schade toe om een duidelijke ECG-opname te garanderen, een aanzienlijke leercurve. Bijgevolg zijn er verschillende alternatieve sondesystemen geïntroduceerd, zoals micro-elektrodenarrays (MEA) en 3D-geprinte sensoren. Zowel ons team als andere onderzoekers hebben met succes MEA gebruikt voor dataverzameling, waarbij data zijn verkregen die een goede signaal-ruisverhouding (SNR) bieden, samen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie15,16,17. Bijvoorbeeld, introduceerden we een MEA die het hart van de vis omhult, waardoor het mogelijk is om locatiespecifieke ECG-signalen vast te leggen15,16. In tegenstelling hiermee ontwikkelde een ander team een ander type MEA op basis van een flexibele gedrukte circuitbord (FPCB) gemaakt van polyimidefilm, gericht op het opnemen van meerdere elektro-encefalogrammen (EEG's) voor epilepsieonderzoek18. Terwijl MEA's het opnemen van talrijke signalen mogelijk maken, zijn ze beperkt door de capaciteit om slechts één vis tegelijk te beoordelen vanwege het beperkte aantal elektrodenkanalen. Als reactie op deze beperking hebben we onlangs een geavanceerd systeem geïntroduceerd dat in staat is tot gelijktijdige ECG-opnamen van meerdere vissen19. Dit systeem gebruikt twee elektroden, elk 125 µm dik en gemaakt van polyimide, met goud-gespoten elektroden gepositioneerd aan de onderkant van hun behuizing om gegevensverzameling te vergemakkelijken. Echter, de opname van een watercirculatiepomp introduceerde ruis, wat de signaal-ruisverhouding (SNR) kwaliteit van de ECG-signalen beïnvloedde. Bovendien was het gebruik van omvangrijke en dure dataverzamelingshulpmiddelen noodzakelijk, die een bekabelde verbinding met een computer vereisten. Op de markt bieden systemen zoals iWORX verbeterde draagbaarheid door een compacte versterker, maar ze staan voor onopgeloste problemen: (i) hun opnametijd is te kort (3-5 min) voor experimenten die langere duur nodig hebben, zoals die met acute geneesmiddeleffecten; (ii) de vereiste voor anesthesie van de dieren, wat hen kan stressen en intrinsiek cardiaal elektrofysiologisch data kan vervormen; (iii) handmatige, sequentiële metingen belemmeren onderzoek met grote aantallen vissen; en (iv) de noodzaak voor offline, arbeidsintensief ECG-gegevensverwerking

<table><tbody><tr><td>Amiodarone Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1164-1G</td><td>Amiodarone poeder</td></tr><tr><td>Benchtop pH/mV Meter</td><td>Sper Scientific</td><td>10500308</td><td></td></tr><tr><td>Ethyle3-Aminobenzoate, Methanesulfonic Acid Salt, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC118002500</td><td>Tricaine poeder</td></tr><tr><td>Isotemp Hot Plate Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88854200</td><td></td></tr><tr><td>Zebra II System</td><td>Sensoriis</td><td>N/A</td><td>Commercieel Zebrafish ECG-opnamesysteem</td></tr><tr><td>Zebrafish ECG System</td><td>iWorx</td><td>ZS-200</td><td>Commercieel Zebrafish ECG-opnamesysteem</td></tr></tbody></table>

zebra ii als een nieuw systeem om elektrofysiologische signalen bij zebravissen op te nemen

Zebra II as A Novel System to Record Electrophysiological Signals in Zebrafish

Zebrafish en hun mutante lijnen zijn uitgebreid gebruikt in biomedisch onderzoek, cardiovasculaire studies en geneesmiddelenscreening. In het huidige onderzoek wordt de commerciële versie van het nieuwe systeem, Zebra II, gepresenteerd. Het protocol demonstreert de verwerving en analyse van elektrocardiogram (ECG) van meerdere zebravissen in controleerbare werkomgevingen. Het apparaat bestaat uit een extern en onafhankelijk perfusiesysteem, een 4-punts elektrode, temperatuursensoren en een ingebouwd elektronisch systeem. In eerdere studies onderging het apparaatoptype validatie tegen het gevestigde iWORX-systeem via verschillende tests, waarbij vergelijkbare gegevenskwaliteit en ECG-respons op medicamenteuze interventies werden aangetoond. Hierna ging het onderzoek verder met het onderzoeken van de invloed van anesthetische geneesmiddelen en temperatuurschommelingen op het ECG van zebravissen, wat onmiddellijke gegevensevaluatie vereiste. Dankzij de capaciteit van het apparaat voor consistente aflevering van anesthetica en geneesmiddelen, was het mogelijk om de ECG-gegevensverzameling tot 1 uur te verlengen, wat aanzienlijk langer is dan de 5 minuten duur die door huidige systemen wordt ondersteund. Dit artikel introduceert een baanbrekende, cloudgebaseerde, geautomatiseerde analyse met behulp van gegevens van vier zebravissen, wat een efficiënte methode biedt voor het uitvoeren van combinatie-experimenten en een aanzienlijke vermindering van tijd en moeite. Het systeem bleek effectief te zijn in het vastleggen en analyseren van ECG, met name bij het detecteren van door geneesmiddelen veroorzaakte aritmieën bij wild-type zebravissen. Bovendien maakte de mogelijkheid om gegevens over meerdere kanalen te verzamelen de uitvoering van gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken met zebravismodellen mogelijk. Het ontwikkelde ECG-systeem overwint bestaande beperkingen en toont het potentieel om de ontdekking van geneesmiddelen en cardiovasculair onderzoek met zebravissen aanzienlijk te versnellen.

De mogelijkheid om gelijktijdig ECG-signalen van meerdere vissen vast te leggen onderscheidt dit apparaat aanzienlijk, wat een aanzienlijk voordeel biedt in het verminderen van de tijd die nodig is voor medicijn- of hartonderzoek bij zebravissen of andere soortgelijke soorten (Figuur 1). Het vastleggen van nauwkeurige ECG-signalen kan uitdagend zijn vanwege de anatomische variaties tussen vissen, vooral wat betreft de plaatsing van de elektroden. Traditioneel vereist het verkrijgen van een duidelijk ECG-signaal dat de actieve elektrode over het hart wordt geplaatst om het vastleggen van mechanische slagen of bewegingsartefacten te voorkomen, waarbij de referentie-elektrode richting de onderbuik wordt geplaatst. Het nauwkeurig bepalen van de locatie van het hart kan echter moeilijk zijn vanwege de diepte in het weefsel of het ongelijkmatige oppervlak van de vis. Soms moeten elektroden met micromanipulatoren worden gemanoeuvreerd voor een nauwkeurige plaatsing, wat meerdere pogingen kan vereisen voordat er een signaal van goede kwaliteit wordt vastgelegd.
Om deze uitdagingen te overwinnen, introduceert het systeem een innovatieve aanpak door een configuratie van vier elektroden te gebruiken in plaats van conventionele enkelvoudige werkelektroden. Elke elektrode functioneert onafhankelijk, waardoor aanpassingen in drie dimensies mogelijk zijn: omhoog en omlaag (heave), naar voren en achteren kantelen (pitch) en roteren rond de verticale as (roll). Deze flexibiliteit blijkt bijzonder nuttig bij het werken met vissen van verschillende vormen, aangezien het een precieze positionering van de elektroden mogelijk maakt om enerzijds het optimale ECG-signaal vast te leggen of anderzijds te onderzoeken hoe de ECG-metingen variëren bij verschillende contactpunten op de vis.
Deze functie verhoogt niet alleen de efficiëntie van cardiale en geneesmiddelenstudies, maar verbreedt ook de mogelijkheden voor ECG en zelfs ECG-registratietechnieken. Aangezien deze methoden nog niet zijn gestandaardiseerd en vaak worden aangepast aan de specifieke condities van het experimentele subject, opent dit apparaat nieuwe wegen voor onderzoek door meer aanpasbare en betrouwbare methoden voor gegevensverzameling te bieden (Figuur 2).
Een van de kenmerkende eigenschappen van dit systeem is het vermogen om tot vier verschillende geneesmiddelen gelijktijdig bij vier afzonderlijke vissen te evalueren, of om de effecten van tot vier verschillende doses van één enkel geneesmiddel bij vier verschillende vissen te onderzoeken. De experimentele opzet kan variëren van een korte acute blootstelling tot langere sessies van 1 h, waarbij gebruik wordt gemaakt van variabele doses van het geneesmiddel of veranderingen in omgevingscondities zoals temperatuur en anesthesie. In deze studie hebben we een kort experiment uitgevoerd om de effectiviteit van de methode aan te tonen, waarbij specifiek de functionaliteit van de array met vier elektroden werd belicht. We hebben drie verschillende doses Amiodarone getest, een klasse-III anti-aritmicum dat bekend staat om het induceren van bradycardie en het verlengen van het QT-interval bij zebravissen, over een blootstellingsperiode van 5 min, vergelijkbaar met een eerdere studie20 waarin het eerste prototype van dit apparaat werd gebruikt.
In overeenstemming met eerder onderzoek vertoonden de vissen zowel een verlengd QTc-interval als een vermindering van de hartslag in vergelijking met de onbehandelde controlegroep. Ondanks de korte blootstellingstijd, die korter is dan in veel vergelijkbare studies die tot 1 h doorlopen, waren wij in staat om significante veranderingen in de ECG-signalen en cardiale parameters waar te nemen (Figuur 3).
Hoe behandeling met Amiodarone leidde tot waarneembare wijzigingen in het ECG, die toenamen bij een hogere dosering, is geïllustreerd in Figuur 3A,B. Opvallend is dat het QTc-interval bij elke opeenvolgende doseringsverhoging verlengde ten opzichte van de controlegroep, die een QTc-interval van 330 ms vertoonde. In de behandelde groepen werden de QTcs-intervallen gemeten op 365 ms voor 70 µM Amiodarone, 480 ms voor 100 µM en 546 ms voor 200 µM. In overeenstemming hiermee werd een opmerkelijke afname van de hartslag waargenomen als reactie op de verschillende Amiodarone-doseringen en de verlengde QTcs-intervallen. De hartslag daalde significant van een gemiddelde van 120 ±5 BPM in de controlegroep naar 105 ±10 BPM bij 70 µM Amiodarone, 90 ± 5 BPM bij 100 µM en 84 ±5 BPM bij 200 µM (Figuur 3C,D).
Op basis van deze resultaten kunnen we concluderen dat de nieuw voorgestelde techniek een vergelijkbare kwaliteit vertoont als in eerdere studies17,18, waarbij een benadering met twee elektroden wordt gebruikt (één werkelektrode en één referentie-elektrode). We hebben succesvol gegevens verzameld van vier werkelektroden, waarbij de optimale elektrode voor analyse werd geselecteerd om vervolgens de verwachte cardiale parameters te rapporteren. De selectiecriteria komen overeen met die van eerdere methoden, waarbij de nadruk ligt op de noodzaak om het PQRST-complex duidelijk te visualiseren en een laag basislijnruis in het ECG-signaal te hebben. Dit maakt de berekening van QT- en QTc-intervallen mogelijk en vergemakkelijkt de identificatie van duidelijke verschillen. Daarnaast is de methodologie verder gevalideerd door tests uitgevoerd door drie aanvullende onderzoekers uit onze groep die niet hadden deelgenomen aan de ontwikkeling van het huidige apparaat. Zij implementeerden eerst de voorlopige methodologie die door de ontwerpers was voorgesteld en suggereerden vervolgens wijzigingen op basis van hun feedback, wat leidde tot de verfijning van de nu gepresenteerde aanpak. Dit iteratieve proces van verbetering was cruciaal voor de optimalisatie van het apparaat, waarbij inzichten van externe onderzoekers zijn benut om het gebruiksvriendelijker en effectiever te maken voor toekomstige toepassingen.
Deze korte studie naar geneesmiddelrespons onderstreept de bekwaamheid van het apparaat om niet alleen gelijktijdig ECG's van vier verschillende vissen onder verschillende condities op te nemen, maar ook om meerdere (vier) ECG-signalen per vis vast te leggen. Deze multifunctionele capaciteit vermindert aanzienlijk de tijd en inspanning die nodig zijn voor de plaatsing van elektroden en minimaliseert de kans op menselijke fouten door een selectie aan signalen te bieden. Deze keuze maakt het mogelijk om ofwel het meest nauwkeurige signaal te selecteren, of om gegevens van meerdere signalen te aggregeren op basis van het doel van de studie. Het is echter belangrijk om te verduidelijken dat het gebruik van de opstelling met vier elektroden er niet automatisch voor zorgt dat alle vier de signalen zuiver en van hoge kwaliteit zullen zijn. Het hoofddoel van de introductie van deze innovatieve functie is om menselijke fouten te verminderen en tijd te besparen door vier gelijktijdige opnames mogelijk te maken in plaats van opeenvolgende opnames, wat tijdsefficiënter is en minder stressvol voor de vissen, gezien hun beperkte tolerantie voor de tijd buiten het water en onder anesthesie.
<img alt="Schema van de elektrofysiologische opstelling met Zebra II-systeem, 4-elektrodehouder en multielektrodenmatrix." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Zebra II-systeem. (A) Isometrisch aanzicht van het Zebra II-apparaat (SolidWorks-model) met gelabelde componenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Diagram van multi-elektrode ECG-opstelling en resultaten voor monitoring van het vissenhart; gegevens van kanalen 1-4 worden getoond." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2: Positionering van elektroden bij Zebravissen. (A) Vrijheidsgraden van de 4-punts elektrodehouder (conceptueel beeld). (B) Positionering van elektroden op de borst van de vis. (C) ECG-signaal van de 4-punts elektrodehouder (Kanalen 1-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Electrocardiogramanalyse, QTc-interval, ECG-analyse onder amiodaron-dosering, hartslaggrafieken." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3: Effecten van acute amiodaronblootstelling (ECG-signalen). (A) Representatieve ECG-gegevens verkregen uit het systeem en de verandering in ECG-parameters als gevolg van verschillende amiodaronconcentraties. (B) Verandering in het ECG door blootstelling aan amiodaron. (C) Staafdiagram dat het verschil in HR beschrijft. (D) Staafdiagram dat het verschil in het QTc-interval in ECG-gegevens beschrijft bij verschillende amiodaronconcentraties. *p&lt;0,05 (éénweg-variantieanalyse met Tukey-toets). Foutenbalken geven de standaarddeviatie weer. Deze figuur is aangepast naar20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De studie introduceert Zebra II, een geavanceerd systeem voor langdurige ECG-acquisitie en analyse bij zebravissen. Dit systeem beschikt over een onafhankelijk perfusiesysteem en meerpuntselektroden voor het behandelen van meerdere vissen in gecontroleerde omgevingen. De acute effecten van Amiodarone werden beoordeeld en geanalyseerd met wild-type zebravissen.

Zebra II als een nieuw systeem om elektrofysiologische signalen bij zebravissen op te nemen

Zebrafish and their mutant lines have been extensively used in biomedical investigations, cardiovascular studies, and drug screening. In the current ...

Ons onderzoeksgroep aan UC Irvine ontwikkelt nieuwe tools om elektrofysiologische beoordeling bij zebravissen te bieden met betere prestaties en langere duur. Ons systeem is gebruikt om cardiale genen te bestuderen en geneesmiddelenonderzoek uit te voeren met behulp van zebravissen. De huidige uitdagingen in elektrofysiologische zebravis-experimenten zijn gebaseerd op korte opnametijden, die minder dan vijf minuten kunnen zijn.Dit verlengt de duur van het experiment, wat de steekproefomvang beperkt en de experimentlengte beïnvloedt. Onze techniek maakt tot een uur opname van multikanaals ECG mogelijk, en het is uitbreidbaar naar EEG, terwijl anderen beperkt zijn tot één kanaal in vijf minuten. Nou, ik denk dat het gaat over hoe we de optische gegevens van het zebravishart kunnen gebruiken, in correlatie met de elektrocardiografie, om de cardiale pathologie en ontwikkelingsstoornissen te bestuderen, vooral in de context van preklinische geneesmiddelontwikkeling.Ik denk dat het gaat erom hoe we onze expertise die we ontwikkelen in optische, elektrische en chemische detectie samen met kunstmatige intelligentie kunnen gebruiken om zebravissen als een kosteneffectief diermodel te gebruiken voor de ontwikkeling van geneesmiddelen in een preklinisch stadium voor cardiovasculaire geneeskunde, neurologie, neuropsychologie en pijngeneeskunde. Om te beginnen, verdeel 40 vissen gelijkmatig in vier groepen en huisvest ze in afzonderlijke tanks. Sluit het Zebra2-apparaat aan op een stroombron en start de werking met de rode knop op het voorpaneel.Navigeer via het touchscreen van het apparaat om de te configureren kamer te kiezen. Stel de low-filter in op 0,1 hertz en de high-pass filter in op 500 hertz en stel de versterking in op 10.000. Til het voorklepje op om toegang te krijgen tot de vier kamers voordat u met het experiment begint.Dompel de spons van elke kamer onder in tricaine-oplossing en pers eventueel overtollig vocht eruit. Draai de vier-elektrode-array zodat de spons toegankelijk is voordat u de vis introduceert. Voor de behandeling, los 258,13 milligram amiodarone op in één liter gedeïoniseerd water.Plaats een magnetische roerder in de container en roer tot de oplossing volledig is opgelost en helder is. Verdun de amiodarone-stockoplossing om 70, 100 en 200 micromolar werkoplossingen in viswater te bereiden. Dompel de vissen individueel onder in de respectieve amiodarone-oplossing gedurende exact vijf minuten.Om te beginnen, behandel de vissen met geschikte concentraties amiodarone. Nadat de vissen zijn verdoofd, plaats ze op de spons met de buikzijde omhoog. Plaats de vooraf ingestelde elektrode-array in een ruitvormige vorm over het borstgebied van de vis om signalen vanuit vier verschillende punten tegelijkertijd vast te leggen.Draai vervolgens elke elektrode, waardoor de pin wordt verlaagd tot het contact maakt met de onderkant van de vis. Als de pin te hoog is, draai de bijbehorende draadmoer met de klok mee om hem te verlagen totdat deze de vis raakt. Sluit de kamerdeksels eens alle elektrode-arrays correct zijn gepositioneerd over de vis in de operationele kamers.Om elke kamer voor opname te markeren, selecteer deze op het touchscreen en start vervolgens de opname met de Record-knop op het scherm. Na twee minuten, klik op de Stop-knop en klik vervolgens op Save in het promptvenster dat verschijnt. Afhankelijk van uw specifieke onderzoeksbehoeften, slaat u de informatie op op een schijf of in de cloud.Om te beginnen, start de elektrocardiogram- of ECG-acquisitie van de met amiodarone behandelde vissen. Voor probleemoplossing, druk op de Stop-knop op de apparaatinterface om het opnameproces te stoppen en identificeer de kanalen met inconsistente signalen. Til het voorklepje op om toegang te krijgen tot de elektrodekamers en identificeer de kamer en specifieke elektroden die het probleem veroorzaken.Draai de bovenste draadmoer met de klok mee om de nabijheid van de elektrode tot de vis aan te passen, waardoor de elektrode dichter bij de vis wordt gebracht. Als het gewoon dichterbij komen het probleem niet oplost, draai de elektrode naar een andere plek op de vis tot een bevredigend signaal is bereikt. De controlegroep vertoonde een consistente hartslag van ongeveer 120 slagen per minuut en een QTc-interval van 330 milliseconden, wat normale ECG-patronen vertoont.Amiodarone-behandeling resulteerde in een dosisafhankelijke toename van het QTc-interval, uitgebreid van 365 milliseconden bij 70 micromolar tot 546 milliseconden bij 200 micromolar en een overeenkomstige afname van de hartslag van ongeveer 105 slagen per minuut bij 70 micromolar tot 84 slagen per minuut bij 200 micromolar.

zebra-ii-as-novel-system-to-record-electrophysiological-signals

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video shows how to perform electrocardiography (ECG or EKG) measurements, a test which measures the electrical activity of the heart, on a zebrafish.

Zebrafish Electrocardiography (ECG): A Minimally Invasive Assay to Evaluate Cardiac Function

Het protocol beschrijft de procedure om elektrofysiologie uit te voeren bij volwassen zebravissen. Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van neurale activiteit in vivo.

Volwassen zebravis elektrofysiologie: een methode om de extracellulaire elektrische activiteit van neuronen in vivo te meten

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Het gebruik van een 3D automatisch videosysteem dat individuele en groepen zebravissen kan volgen, wordt beschreven. Als toepassingsvoorbeeld onderzoeken we de effecten van de NMDA-receptorantagonist MK-801 op scholen zebravissen.

Een geautomatiseerd 3D-trackingsysteem gebruiken om individuele vissen en groepen volwassen zebravissen te registreren

Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.

Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode

Hier presenteren we een betrouwbare, minimaal invasieve en kosteneffectieve methode om elektrocardiogrammen op te nemen en te interpreteren in levende verdoemde volwassen zebravis.

In vivo oppervlakte elektrocardiografie voor volwassen zebravis

Leer het Zebra II-systeem voor langdurige ECG-registratie bij zebravissen met meerkanaals elektroden. Deze methode maakt tot een uur opname mogelijk voor cardiaal onderzoek en geneesmiddelscreening.

Zebra II als een nieuw systeem om elektrofysiologische signalen bij zebravissen op te nemen

Meer video's verkennen