Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers
31 januari 2025
Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).
Circulerende extracellulaire blaasjes als biomarkers zijn een relatief nieuw veld in het onderzoek naar biomarkers met een enorm potentieel. Ons protocol is bedoeld om een praktische benadering te bieden voor het implementeren van extracellulaire vesikel gebonden biomarker ontdekking en detectie in een spoedeisende hulpafdeling. Opkomend bewijs heeft aangetoond dat de moleculaire lading die in extracellulaire blaasjes en bloedsomloop wordt aangetroffen, eiwitten en RNA bevat die van belang zijn in meerdere ziektecontexten.
Verschillende nieuwe extracellulaire blaasjes, ingesloten biomarkers zijn in verband gebracht met de diagnose en prognose van verschillende entiteiten van hart- en vaatziekten. Grote uitdagingen op het gebied van de ontdekking van circulerende extracellulaire blaasjes zijn het behoud van extracellulaire blaasjes en plasma-acquisitie afhankelijk van de dynamiek van EV-afgifte. Daarom is een strikt protocol dat is ingebed in de klinische routine nodig om EV-degradatie te voorkomen en reproduceerbare resultaten te behouden, vooral bij het toepassen van grootschalige analysemethoden zoals proteomics.
De ontdekking van eiwitbiomarkers die zijn ingesloten in circulerende EV is sterk afhankelijk van het tijdstip van de eerste bloedafname in verhouding tot het begin van de symptomen en de opslagduur van het monster als gevolg van natuurlijke EV-afbraak. Dit protocol biedt een hands-on protocol voor plasma-EV-isolatie en introductie in proteomics-analyse dat kan worden geïntegreerd in de klinische workflow van een afdeling spoedeisende hulp. Ons komende onderzoek zal zich richten op het integreren van verschillende patiëntencollectieven in onze methodologie, waaronder patiënten met gedecompenseerd hartfalen, aritmieën of tachycardie-cardiomyopathie, evenals longitudinale studies van patiënten die een bypassoperatie ondergaan.
Met behulp van dit protocol willen we nieuwe EV-gebonden biomarkers identificeren die bijdragen tot de diagnose en prognose van bovengenoemde pathologieën. Om te beginnen centrifugeert u het menselijk bloedplasma, met behulp van een ultracentrifuge met een rotor met een vaste hoek zonder te breken. Nadat het puin en het apoptotische lichaam zijn bezonken, brengt u het bovenstaande over naar een nieuwe buis en centrifugeert u ultra bij 100.000 G gedurende twee uur bij vier graden Celsius zonder te breken om extracellulaire blaasjes te isoleren.
Verwijder de buis voorzichtig na de ultracentrifugatie. Zuig met behulp van een elektronische pipet voorzichtig het supernatant op, waardoor ongeveer een milliliter extracellulair blaasjesverarmd plasma overblijft. Schakel over op een pipet van 1000 microliter om het resterende plasma voorzichtig te pipetteren zonder de extracellulaire blaasjespellet te verstoren.
Kantel de buis geleidelijk tijdens het pipetteren om ervoor te zorgen dat er geen plasma achterblijft en suspendeer de pellet opnieuw in PBS. Verdun vervolgens de extracellulaire vesikel stockoplossing met ijskoude PBS in verschillende verhoudingen om een eindtellingsbereik van 10 tot 100 nanodeeltjes per frame te bereiken tijdens het volgen. Schakel het NTA-instrument in en start de toepasselijke software op de aangesloten computer.
Plaats de kamer in de laserkist en klik op camera starten om deze te activeren. Zuig een milliliter PBS op in een spuit en sluit deze aan op de voorste buis. Spoel het slangsysteem grondig door en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer achterblijven.
Houd de camera in de gaten om luchtbellen of vervuilende deeltjes te detecteren. Zuig nu de voorbereide werkende verdunning van het extracellulaire blaasje op in een spuit van één milliliter en injecteer deze in de kamer. Ga naar de tabbladen vastleggen en verwerken om de schermversterking aan te passen aan de helderheid van de monitor.
Pas het cameraniveau aan om de differentiatie van nanodeeltjes op het scherm te verbeteren. Stel een geschikte detectiedrempel in op het tabblad Proces om deeltjes te onderscheiden van achtergrondgeluid. Stel de camera scherp met behulp van het scherpstelwiel aan weerszijden van het instrument totdat nanodeeltjes scherp op het scherm verschijnen.
Nadat u in de hardware-instellingen een constante temperatuur van 22 graden Celsius hebt ingesteld voor alle metingen, klikt u op de knop Uitvoeren om de meting te starten. Neem ten minste drie video's van elk 30 seconden op voor elke samplerun. Klik op wijzigen om de verdunningsfactor van de monsters in te voeren en klik ten slotte op exporteren om de resultaten op te slaan.
Met behulp van nanodeeltjesvolganalyse werden extracellulaire blaasjes geïdentificeerd en gevisualiseerd op basis van brownie en beweging. De analyse onthulde een gemiddelde deeltjesconcentratie van 1,2 keer 10 tot de macht van 10 deeltjes per milliliter in plasma van gezonde individuen die de aanwezigheid van extracellulaire blaasjes aantonen. De gemiddelde grootte van extracellulaire plasmablaasjes werd gemeten op 184,7 nanometer, consistent met typische extracellulaire blaasjesafmetingen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de isolatie en karakterisering van extracellulaire vesikels (EV's) afgeleid van menselijk plasma. Er wordt nadruk gelegd op het belang van het behoud van de integriteit van EV's voor een nauwkeurige biomarker-ontdekking in klinische settings.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biomarkeronderzoek
- Extracellulaire blaasjes
- Proteomics
Achtergrond
- Extracellulaire blaasjes blijken belangrijke biomarkers te zijn bij diverse ziekten.
- Ze bevatten eiwitten en RNA die inzicht kunnen geven in ziektestadia.
- Uitdagingen zijn onder meer het behoud van EV's en de dynamiek van plasma-acquisitie.
- Een robuust protocol is essentieel voor reproduceerbare resultaten bij biomarkeranalyse.
Doel van de studie
- Om een praktische methodologie te bieden voor de ontdekking van EV-biomarkers.
- Om de implementatie van dit protocol in spoedeisende hulpafdelingen te faciliteren.
- Om het begrip van de moleculaire vracht van EV's bij cardiovasculaire aandoeningen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Isolatie van extracellulaire vesicles uit menselijk plasma.
- Karakterisering en kwantificering van EVs.
- Labelvrije analyse van het EV-proteoom.
- Vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor proteomische analyse.
Belangrijkste resultaten
- Een strikt protocol ontwikkeld om degradatie van EV's te voorkomen.
- Het potentieel van EV's als biomarkers voor cardiovasculaire ziekten aangetoond.
- Een workflow verzorgd voor effectieve proteomische analyse van EV's.
- Het belang van EV-conservering in klinische toepassingen benadrukt.
Conclusies
- De methodologie verbetert de betrouwbaarheid van de ontdekking van EV-biomarkers.
- Het ondersteunt de integratie van EV-analyse in de routinematige klinische praktijk.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit protocol om EV's in andere ziektecontexten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Gestandaardiseerde isolatie en proteomische analyse van uit plasmaderiverende extracellulaire vesicles (EV's) vult een kritisch hiaat op in de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers door een reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling van circulerende moleculaire lading mogelijk te maken. Deze workflow ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets in een vroeg stadium en informeert translationele biomarkerstrategieën voor cardiovasculaire ziekteportfolio's. De integratie van EV-analyse in klinische monsterpipelines verhoogt de betrouwbaarheid van door biomarkers gestuurde beslismomenten in zowel discovery- als preklinisch onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar met EV's geassocieerde eiwitvracht mogelijk voor de identificatie van nieuwe cardiovasculaire biomarkers.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de moleculaire samenstelling van circulerende EV's in patiëntenmonsters te verduidelijken.
- Vergemakkelijkt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door kwantitatieve proteomische resultaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde protocollen voor de isolatie en kwantificering van EV's voor de ontwikkeling van downstream-assays.
- Waarborgt de reproduceerbaarheid en standaardisatie van EV-metingen over klinische cohorten heen.
- Levert kwantitatieve gegevens van nanoparticle tracking en immunoblotting voor de kalibratie van de assay.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt proteomische EV-profielen uit in lijn met ziekterelateerde patiëntenpopulaties voor translationele biomarker-exploratie.
- Maakt longitudinale studies van EV-biomarkers in diverse cardiovasculaire aandoeningen mogelijk.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang van biomarker-kandidaten naar preklinische validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol plaatst de isolatie van EV's en proteomische analyse op het snijvlak van klinische monsterwerving en biomarkerontdekking, waardoor een brug wordt geslagen tussen vroege ontdekking en translationeel onderzoek naar hart- en vaatziekten.
- Discovery Biology: Kwantitatieve EV-proteomics ondersteunt hypothesetesten en mechanistische risicoreductie van kandidaat-biomarkers.
- Screening: Gestandaardiseerde EV-kwantificering en markerverrijking maken assay-gereedheid en reproduceerbaarheid mogelijk.
- Analytics: Nanodeeltjes-tracking en massaspectrometrie bieden robuuste, kwantitatieve resultaten voor vergelijkingen tussen monsters.
- Translationeel Onderzoek: Integratie met klinische workflows faciliteert de continuïteit van biomarkers van patiëntenmonsters naar preklinische modellen.
- Enterprise Hergebruik: Het protocol is aanpasbaar voor diverse cardiovasculaire patiëntcohorten en longitudinale studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontdekking van biomarkers.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare workflows voor de isolatie en analyse van EV's.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door robuuste biomarker-validatie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van biomarker-kandidaten voor cardiovasculaire indicaties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in ultracentrifugatie, nanodeeltjes-tracking en proteomische analyse.
- Vereist toegang tot hogesnelheidscentrifuges, NTA-instrumenten en LC-MS/MS-platformen.
- Necessiteert strikte naleving van protocollen voor monsterbehandeling en -opslag om degradatie van EV's te voorkomen.
- Moet indien nodig worden aangepast voor verschillende patiëntenpopulaties en klinische workflows.
- Afhankelijk van het tijdstip van de bloedafname en de bewaarduur om de integriteit van de gegevens te waarborgen.
