Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Het doel van dit onderzoek is het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie onder fysiologische omstandigheden. We bestuderen specifiek de bloedplaatjesfunctie met behulp van microfluïdische apparaten en biologische oppervlakken. En met behulp van deze aanpak waren we in staat om vragen te beantwoorden met betrekking tot dysfunctie van bloedplaatjes en hemostatische reanimatie voor toepassingen in de transfusiegeneeskunde.

De huidige bloedplaatjesfunctietesten testen vaak het vermogen van bloedplaatjes om te aggregeren als reactie op een specifieke agonist naar keuze. Detectiemethoden kunnen lichttransmissie of elektrische impedantie omvatten, en deze tests kunnen procesmonsters gebruiken en worden stilstaand getest. Door deze microfluïdische benadering te gebruiken om de bloedplaatjesfunctie te testen, integreren we vloeistofdynamica om fysiologische relevantie toe te voegen.

Vloeistofdynamica speelt een cruciale rol in biologische mechanismen die betrokken zijn bij de bloedplaatjesfunctie tijdens hemostase. Bij bloedende patiënten maken we ons vooral zorgen over de bloedplaatjesfunctie en therapeutische interventies die die functie kunnen verbeteren voor betere resultaten. Met behulp van deze benadering voor het testen van de bloedplaatjesfunctie kunnen we de bijdragen van verschillende bloedplaatjespopulaties in een experiment volgen en een manier ontsluiten om therapeutische opties voor trauma en andere bloedingsaandoeningen te beoordelen.

Giet om te beginnen de basis van siliconenelastomeer in een weegschaal. Voeg het siliconenuithardingsmiddel toe in een verhouding van tien op één en roer het mengsel grondig om een goede verknoping van de siliconenpolymeerketens te garanderen. Plaats de mastervorm in een petrischaal en giet de niet-uitgeharde PDMS gelijkmatig op de vorm.

Plaats vervolgens de petrischaal 30 minuten in een vacuümexsiccator om bubbels uit het mengsel te verwijderen. Om het uitharden van de PDMS te voltooien, plaatst u de vorm in een oven die is ingesteld op 70 graden Celsius gedurende 90 minuten. Gebruik na volledige PDMS-uitharding een scheermesje of scalpel om het microfluïdische gips weg te snijden.

Pons gaten aan de randen van de kanalen. Plaats nu het glasplaatje en het microfluïdische gietstuk met de geëtste kant naar boven in een plasmareiniger. Start de vacuümpomp en sluit de kamer af.

Zet vervolgens de plasmareiniger op de hoogste stand en laat de opstelling 30 seconden in de reiniger staan. Schakel daarna de plasmareiniger uit en laat het vacuüm los. Om het plasmagereinigde gietstuk en de glasplaatje te binden, drukt u de zijkanten die naar boven lagen in de plasmareiniger voorzichtig op elkaar.

Plaats het microfluïdische apparaat gedurende 10 minuten in een oven of op een hete plaat op 70 graden Celsius om het bindproces af te ronden. Smeer nu de microfluïdische kamer in met type-één equine fibrillair collageenreagens via een aangewezen uitlaat naar de aangewezen inlaat. Bewaar het apparaat in een warme, vochtige, gesloten container om te voorkomen dat het gecoate collageen in het kanaal verdampt.

Spoel het apparaat na een uur af met PBS in de tegenovergestelde richting van de coating om de collageenoplossing weg te spoelen. Incubeer om te beginnen citrerend volbloed met een fluorescentiegeconjugeerd CD41-antilichaam, met behulp van een fluorofoor naar keuze. Kleur het bloed gedurende 30 minuten op een nutating rocker.

Schakel vervolgens de microscoop en de bijbehorende software in. Stel de pomp van de ontgasspuit waterpas in met de microscooptafel en pas de instellingen van de spuitpomp aan volgens de experimentele vereisten. Plaats vervolgens het microfluïdische apparaat op de microscooptafel en plak de randen op de tafel om beweging te voorkomen.

Sluit nu de slang met een inwendige diameter van een zestiende inch aan op een elleboogconnector en vervolgens op een spuit van 10 milliliter met een connector met een zestiende van een inch connector met een inwendige diameter. Vul de spuit van 10 milliliter met steriel PBS en sluit deze aan op de spuitpomp. Steek vervolgens de elleboogconnector in de uitlaat van het microfluïdische apparaat.

Bereid inlaatleidingen van ongeveer 10 centimeter lang voor met een elleboogconnector aan het ene uiteinde en een schuine snede aan het andere uiteinde. Sluit nu de inlaatelleboogconnector aan op de inlaat van het apparaat en plaats de inlaatleiding in een microcentrifugebuis voor afval die op een schuine houder is geplaatst. Gebruik de 10-voudige objectieflens om scherp te stellen op de kanaalranden van het microfluïdische apparaat.

Bereid vervolgens de lijnen voor met PBS. Beweeg de spuitpomp handmatig vooruit om het kanaal vrij te maken van PDMS of vuil. Controleer in de buurt van de kanaalinlaat en -uitlaat op obstakels.

Open nu de instellingen voor het vastleggen van opgeslagen afbeeldingen of maak een nieuwe procedure voor het vastleggen van afbeeldingen in tijdreeksen die elke één tot twee seconden zijn vastgelegd met een helder veldkanaal en fluorescerende kanalen die overeenkomen met de CD41-antilichamen in het bloedmonster. Verkrijg het gefilterde gecitreerde bloedmonster en meng het door op en neer te pipetteren vlak voor het starten van het experiment. Plaats het monster op de schuine microcentrifugehouder.

Plaats vervolgens de inlaatlijn in het bloedmonster en begin met het opnemen van de afbeelding. Trek de spuit langzaam terug om het dode volume in de slang te vullen. Zodra het bloed het kanaal bereikt, drukt u onmiddellijk op Play op de spuitpomp om de stroom met de gewenste snelheid te hervatten.

Voer het experiment uit totdat de bloedplaatjes het stenotische gebied van het microfluïdische apparaat volledig hebben afgesloten, of tot het experimentele eindpunt, dat meestal 10 minuten is. Zodra het experiment is voltooid, stopt u met het vastleggen van de afbeelding en stopt u de spuitpomp. Sla ten slotte de opname van de afbeelding op in de juiste opslag.