Uitvoeren van een in vitro genoombrede CRISPR-knock-outscreening in chimere antigeenreceptor-T-cellen

Car T-celtherapie is een innovatieve vorm van kankerimmunotherapie die heeft geleid tot remissies die meer dan tien jaar aanhouden. De percentages duurzame reacties zijn echter nog steeds beperkt. Met dit protocol willen we ons begrip van de mechanismen achter resistentie vergroten en hulpmiddelen creëren om de respons op CAR T-celtherapie te verbeteren.

Er worden momenteel veel benaderingen gebruikt om CAR T-celtherapie te verbeteren, waaronder combinatietherapieën en optimalisatie van het CAR-ontwerp. Vanwege het toenemende bewijs dat het epigenetische profiel van pre-infusie CAR T-celproducten een belangrijke bepalende respons is, zijn genetische bewerkingstechnologieën echter populaire hulpmiddelen geworden.

Genomische bewerking van CAR T-cellen heeft succes aangetoond bij het voorkomen van toxiciteit en het vergroten van de expansie en persistentie van CAR T-cellen in preklinische en klinische studies. Ons protocol voor een genoombrede CRISPR-knock-outscreening biedt een efficiënte en onbevooroordeelde aanpak om de beste genetische bewerkingen te bepalen om de CAR T-celfunctie te verbeteren.

Genoombrede genverstoringen vereisen grootschalige en adequate selectievoorwaarden om effectief te zijn. Om de ontwikkeling van CAR T-celuitputting te bestuderen, hebben we geleerd dat we gedurende twee weken meer dan 80 miljoen CAR T-cellen moeten stimuleren om optimale genbewerkingen te selecteren.

Hoewel ons protocol is ontworpen om de ontwikkeling van uitputting te evalueren, kan dit protocol worden aangepast om de ontwikkeling van andere weerstandsmechanismen te evalueren. Door genoombrede schermen in verschillende omgevingen in te vullen, kunnen we uiteindelijk de beste bewerkingen bepalen om de algehele respons op CAR T-celtherapie te verbeteren.

[Verteller] Na het transduceren van de CAR T-cellen met de CRISPR-bibliotheek, centrifugeert u de monsters gedurende vijf minuten bij 300 g bij 4 graden Celsius om ze te wassen. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de monsters in 20 milliliter T-celmedium. Om monsters te bewaren voor sequencing van de volgende generatie, moeten voldoende CAR T-cellen in een conische buis van 50 milliliter worden geplaatst om een gids-RNA-representatie van 500 cellen per gids-RNA te behouden. Centrifugeer het monster vijf minuten bij 300 g bij 4 graden Celsius. Resuspendeer vervolgens de celpellet in één milliliter PBS en breng deze over in een microcentrifugebuis van twee milliliter. Was de conische buis van 50 milliliter met één milliliter PBS en breng de was over in dezelfde microcentrifugebuis. Centrifugeer de monsters vervolgens vijf minuten bij 500 g bij 4 graden Celsius. Verwijder het bovenstaande en bewaar de celpellets bij -20 graden Celsius. Om de co-cultuur te starten, voegt u CAR T-cellen toe aan CD19-positieve JeKo-1-cellen in een één-op-één-verhouding. Breng het totale volume van de co-cultuur op 160 milliliter met T-celmedium en bewaar de monsters in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om de CAR T-cellen opnieuw te stimuleren, verzamelt u de co-culturen in conische buisjes van 50 milliliter en centrifugeert u de monsters gedurende vijf minuten bij 300 g bij 4 graden Celsius. Resuspendeer elk monster in 80 milliliter T-celmedium en voeg 80 keer 10 toe aan de sterkte van zes JeKo-1-cellen in 80 milliliter T-celmedium. Bewaar de monsters in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Om op dag 15 de CAR T-cellen uit de co-cultuur te isoleren, telt u eerst de cellen. Combineer een positieve selectiekit voor CD4-positieve T-cellen met een positieve selectiekit voor CD8-positieve T-cellen om T-cellen te isoleren uit de CAR T JeKo-1-coculturen. Tel vervolgens de geïsoleerde T-cellen. Om de monsters te bewaren voor sequencing van de volgende generatie, aliquot 33 keer 10 tot de macht van zes CAR T-cellen in een conische buis van 50 milliliter en centrifugeert het monster vijf minuten bij 300 g bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de celpellet in één milliliter PBS en breng deze over in een microcentrifugebuis van twee milliliter. Was vervolgens de conische buis van 50 milliliter met één milliliter PBS en breng de was over in dezelfde microcentrifugebuis. Na het centrifugeren van de monsters en het verwijderen van het supernatant, bewaart u de celpellets bij -20 graden Celsius. Isoleer om te beginnen genomisch DNA uit bevroren CAR T-celpellets met behulp van een genomische DNA-isolatiekit. Zuiver het geïsoleerde genomische DNA door ethanolprecipitatie door eerst 100% ethanol voor te koelen tot -20 graden Celsius. Aliquot het geëlueerde DNA gelijkmatig in verschillende microcentrifugebuisjes, zodat elke aliquot 200 tot 250 microliter is. Voeg twee volumes voorgekoelde 100% ethanol, 0,1 volume driemolair natriumacetaat en één microliter van 20 milligram per milliliter glycogeen toe. Incubeer de monsters een nacht bij -20 graden Celsius. Draai de monsters op de tweede dag gedurende 20 minuten op 13.000 g om het neergeslagen DNA te pelleteren. Verwijder het bovenstaande en was de pellets met een milliliter 70% ethanol door gedurende 10 minuten op 7.500 g te draaien. Nadat de pellets volledig zijn gedroogd, resuspendeert u de pellets in 50 microliter steriel water. Om het genomische DNA voor te bereiden op sequencing van de volgende generatie, stelt u een PCR in met het gespecificeerde reactiemengsel dat hier wordt getoond. Voer vervolgens de PCR uit met behulp van de volgende cyclusomstandigheden. Trek de PCR-reacties voor elk monster en zuiver het PCR-product met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Voer voor elk monster drie microgram van het PCR-product uit op een agarosegel van 2%. Verwijder het PCR-product uit de gel door het DNA te extraheren met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de geëxtraheerde monsters bij -20 graden Celsius.