In vitro Modellering van neurogenese van het syndroom van Down met behulp van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Onderzoeksfocus op de lange termijn is het vinden van potentiële therapieën voor neurologische aandoeningen bij het syndroom van Down. En onze huidige focus ligt op neurogenese met het syndroom van Down, een belangrijke oorzaak van een verstandelijke beperking. We ontdekten dat verminderde neurogenese door het syndroom van Down wordt veroorzaakt door een bifasisch celcyclusdefect, in tegenstelling tot wat vaak wordt aangenomen dat dit alleen te wijten is aan veroudering van neurale voorlopercellen van het syndroom van Down.

Identificatie van bifasisch celcyclusdefect met behulp van een humaan IPSC-gebaseerd protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, zal potentiële therapeutische strategieën stimuleren, rekening houdend met zowel de toestand van de celcyclus die verminderde proliferatie in de vroege fase is, als het niet verlaten van de celcyclus in de late fase. Voeg om te beginnen 10 micromolair gesteenteremmer toe aan volledige menselijke iPCS's media, DPBS, celloslatingsoplossing en feeder-geconditioneerd medium, aangevuld met 25 nanogram per milliliter basische fibroblastgroeifactor. Verwarm alle reagentia tot 37 graden Celsius.

Neem een bord met zes putjes iPSC's op feeders. Pipetteer de gedifferentieerde kolonies eruit en voeg een vers compleet humaan iPSC-medium toe. Plaats de plaat twee uur op 37 graden Celsius in de kooldioxide-incubator.

Was de putjes na de incubatie één keer met calcium- en magnesiumvrije DPBS. Voeg vervolgens een milliliter celloslatingsoplossing toe aan elk putje. Plaats de plaat op 37 graden Celsius in een kooldioxide incubator gedurende 12 tot 14 minuten.

Bekijk de cellen onder een omgekeerde microscoop. Als de meeste cellen loskomen, maar als sommige blijven vastzitten, tik dan zachtjes vanaf de zijkanten op de plaat. Voeg drie milliliter DPBS aangevuld met calcium en magnesium toe aan elk putje om de celloslatingsoplossing te verdunnen.

Met een pipet van vijf milliliter pipettert u twee tot drie keer voorzichtig om klonten te breken, terwijl u luchtbellen vermijdt. Breng de cellen door een zeef van 40 micrometer in een centrifuge van 50 milliliter 2. Centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 200 G. Gebruik een vacuümaspiratiesysteem om de media voorzichtig op te zuigen.

Suspensie nu de cellen opnieuw in 10 milliliter menselijk iPSC-medium. Breng alle cellen in suspensie over op een schaal van 15 centimeter bedekt met 0,1% gelatine en incubeer in een kooldioxide-incubator. Verzamel de media met cellen in een centrifuge 2.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 200 G.Zuig de media vervolgens voorzichtig op met het vacuümaspiratiesysteem. Resuspendeer de cellen in één milliliter feeder-geconditioneerd medium, aangevuld met 25 nanogram per milliliter BFGF en 10 micromolair gesteenteremmer. Bereid na het tellen van de cellen een suspensie van 30.000 tot 50.000 cellen per milliliter voor.

Zaai de suspensie in een putplaat. Vervang na twee dagen het feeder-geconditioneerde medium door neurale voorlopercel of NPC-medium. Verander de media op dag twee en 18 zoals gegeven.

Vervang op dag 28 het medium in de plaat door NPC-medium aangevuld met 10 micromolair gesteenteremmer. Incubeer de plaat vervolgens twee uur bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator. Zuig na de incubatie de supernatant op en was de putjes eenmaal met calcium- en magnesiumvrije DPBS.

Voeg een milliliter celloslatingsoplossing toe aan elk putje. Bekijk vervolgens de cellen onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 4x. Piket vervolgens drie milliliter met calcium en magnesium aangevuld DPBS in elk putje van de plaat.

Piket met een pipet van vijf milliliter voorzichtig de suspensie en breek eventuele klontjes. Zeef de celsuspensie door een zeef van 40 micrometer die over een centrifuge van 50 milliliter 2 wordt geplaatst. Centrifugeer en aspireer zoals eerder aangetoond, en suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in één milliliter gedefinieerd differentiatiemedium aangevuld met B 27 met vitamine A. Tel levende cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.

Zaai vervolgens 50.000 cellen in elk putje van een gekwalificeerde matrixgecoate plaat met 48 putjes. Vervang op dag 33 het medium in de kweekputjes door neuraal differentiatiemedium. Een significante vermindering van TUBB3-positieve neuronen werd waargenomen in culturen met het syndroom van Down, vergeleken met isogene euploïde cellen, met een ongeveer tweevoudige afname op dag 85.

Een significant lager aandeel KI67-positieve cellen werd waargenomen in culturen met het syndroom van Down tijdens de vroege neurogene fase, vergeleken met isogene euploïde cellen, met een verviervoudiging van de verviervoudiging. In het late neurogene stadium verlieten de meeste isogene euploïde cellen de celcyclus met minimale KI67-kleuring, terwijl de meerderheid van de cellen met het syndroom van Down KI67-positief bleef, met een vijfvoudige toename. Een tweede paar Sown-syndroom en isogene euploïde humane iPSC's bevestigden verlaagde TUBB3-positieve neuronenniveaus en verhoogde PAX6-positieve neurale voorlopercellen in culturen met het syndroom van Down aan het einde van neurale differentiatie, met een tweevoudige vermindering van TUBB3-positieve neuronen en een meer dan tweevoudige toename van PAX6-positieve cellen.