Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes
18 oktober 2024
Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.
Ons onderzoek richt zich op progressieve neurodegeneratieve ziekten die worden gekenmerkt door de accumulatie van het nucleaire eiwit TDP-43 in het cytoplasma, zoals ALS of FTLD-TDP. We willen begrijpen hoe TDP-43-pathologieën zich op een prionachtige manier door de hersenen verspreiden. We ontdekten eerder dat de afgifte van TDP-43 via extracellulaire blaasjes wordt gemedieerd door de ontregeling van autofagie.
Progranuline van de FTLD-TDP vergemakkelijkt dit proces. De volgende uitdaging is om te verduidelijken hoe autofagie de productie en afgifte van extracellulaire blaasjes met TDP-43 reguleert, wat zou kunnen leiden tot de ontdekking van therapeutische doelwitten voor ALS of FTLD-TDP. Neem om te beginnen de gekweekte HeLa-cellen, tel ze met behulp van een cellenteller en zaai een keer tien tot de macht zes cellen op een plaat van zes centimeter met een kweekmedium.
Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur. Bereid vervolgens een 20-micromolaire siRNA-oplossing voor. Meng 100 microliter gereduceerd serummedium en drie microliter siRNA in een buisje met lage retentie om Oplossing A te bereiden.Meng vervolgens 100 microliter gereduceerd serummedium en vijf microliter transfectiereagens in een buisje met lage retentie om Oplossing B te bereiden.Meng daarna Oplossing A en Oplossing B en incubeer het mengsel vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur.
Voeg nu het mengsel van oplossingen A en B toe aan het medium dat wordt gebruikt voor het kweken van HeLa-cellen en incubeer gedurende 24 uur. Was de cellen de volgende dag met PBS en stel de cellen gedurende vijf minuten bloot aan 500 microliter 0,25% trypsine en één millimolaire EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en gecontroleerde vochtigheid. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van het kweekmedium toe aan de cellen en bereid met behulp van een Pasteur-transferpipet met een pipetpunt van 20 microliter eraan een eencellige suspensie voor.
Na het tellen van de cellen, zaad je één keer tien tot de macht zes cellen op een plaat van tien centimeter en broed je uit, zoals eerder aangetoond. Bereid aan het einde van de incubatie het kweekmedium dat vehiculum of 100 nanomolair bafilomycine A1 bevat. Stel de cellen vervolgens bloot aan het medium dat vehiculum of 100 nanomolaire bafilomycine A1 bevat en incubeer gedurende 24 uur. Verzamel de volgende dag al het kweekmedium van de plaat van 10 centimeter.
Breng het verzamelde medium over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 3.000 G bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Om de P1 extracellulaire blaasjesfractie te isoleren, brengt u het supernatans na centrifugatie bij 3.000 G over in een centrifugatiebuis. Centrifugeer de buis bij 20.000 G bij vier graden Celsius gedurende een uur.
Voor de isolatie van de P2 extracellulaire blaasjesfractie brengt u het supernatans na centrifugatie bij 20.000 G over in een ultracentrifugebuis. Centrifugeer het bij 110.000 G bij vier graden Celsius gedurende een uur. Nadat u het overtollige vocht in de buis met een laboratoriumdoekje hebt weggeveegd, resuspendeert u de resterende pellets in de centrifugatiebuis in 50 microliter tweevoudige monsterbuffer om de P1 extracellulaire blaasjesfractie te bereiden.
Verwijder vervolgens het supernatans door te decanteren. Veeg het overtollige vocht in de buis weg met een laboratoriumdoekje en resuspendeer de resterende pellets in de ultracentrifugatiebuis in 50 microliter tweevoudige monsterbuffer om de P2 extracellulaire blaasjesfractie te bereiden. Incubeer de P1 en P2 extracellulaire blaasjesfracties bij 100 graden Celsius op een warmteblok gedurende 10 minuten.
Nadat u het kweekmedium van de plaat van 10 centimeter in een buis van 15 milliliter hebt overgebracht, wast u de cellen in de schaal van 10 centimeter met PBS. Stel de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bloot aan twee milliliter 0,25% trypsine en één millimolaire EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en gecontroleerde vochtigheid. Voeg acht milliliter groeimedium toe aan de cellen.
Gebruik een pasteur-transferpipet met een pipetpunt van 200 microliter eraan om de cellen te pipetteren om een eencellige suspensie te bereiden. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze gedurende 1.000 minuten bij 1.000 G bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatans met behulp van een aspirator.
Voeg PBS toe aan de celkorrel en centrifugeer bij 1.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van de PBS, sonicaat de celpellet in één milliliter A68-buffer met 1% sarcosil. Meng 300 microliter van het cellysaat met 100 microliter viervoudige monsterbuffer.
Incubeer het mengsel bij 100 graden Celsius op een warmteblok gedurende 10 minuten om de celfractie voor te bereiden.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van TDP-43 bij neurodegeneratieve ziekten en de afgifte ervan via extracellulaire vesikels (EV's). Het onderzoek benadrukt de betrokkenheid van autofagie bij het reguleren van de TDP-43-afgifte, wat mogelijk kan leiden tot therapeutische doelwitten voor ALS en FTLD-TDP.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurodegeneratieve ziekten
Achtergrond
- TDP-43 is een kernprotein dat geassocieerd wordt met neurodegeneratieve ziekten.
- ALS en FTLD-TDP worden gekenmerkt door accumulatie van TDP-43 in het cytoplasma.
- Het begrijpen van de TDP-43-pathologie kan inzicht geven in de mechanismen van ziekteverspreiding.
- Extracellulaire blaasjes spelen een rol bij de afgifte van TDP-43.
Doel van de studie
- Om te verduidelijken hoe autofagie de productie en afgifte van TDP-43-bevattende EV's reguleert.
- Om potentiële therapeutische doelwitten voor ALS en FTLD-TDP te verkennen.
- Om de rol van progranuline bij de afgifte van TDP-43 te onderzoeken.
Gebruikte Methoden
- Celkweek van HeLa-cellen.
- Tellen van cellen met behulp van een celteller.
- Uitplaten van cellen in kweekmedium voor experimenten.
- Immunoblotting om de niveaus van autofagosoommarkers te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van de rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's.
- Analyse van de effecten van de remming van de fusie tussen autofagosoom en lysosoom.
- Bewijs voor autofagie-dysregulatie bij de afgifte van TDP-43.
- Facilitatie van de afgifte van TDP-43 via EV's door progranuline.
Conclusies
- Autofagie is cruciaal voor de regulatie van de afgifte van TDP-43.
- Het richten op autofagie kan nieuwe therapeutische wegen openen voor ALS en FTLD-TDP.
- Verder onderzoek is nodig om de betrokken mechanismen volledig te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve evaluatie van de afgifte van LC3-II via extracellulaire blaasjes (EV's) biedt een mechanistisch inzicht in autofagie-afhankelijk eiwittransport, een proces dat betrokken is bij de progressie van neurodegeneratieve ziekten. Dit protocol stelt biofarmaceutische teams in staat om de moleculaire determinanten van pathologische eiwitverspreiding te onderzoeken, wat targetvalidatie en risico-gecorrigeerde voortgang in portfolio's voor neurodegeneratie ondersteunt. Deze aanpak versterkt het voorspellend vertrouwen op het snijvlak van autofagiemodulatie en EV-gemedieerde biomarker-afgifte.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele beoordeling mogelijk van autofagie-gerelateerde genen bij EV-gemedieerde proteïne-export.
- Ondersteunt mechanistische risicovermindering door de impact van kandidaat-targets zoals STX6 op LC3-II-transport te isoleren.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar ziekterelevante pathways bij neurodegeneratie.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare, op immunoblot gebaseerde workflow voor het kwantificeren van LC3-II in cellulaire fracties en EV-fracties.
- Stelt assaycontroles vast met bafilomycine A1 om de remming van de autofagosoom-lysosoomfusie te benchmarken.
- Maakt standaardisatie van EV-isolatie en marker-kwantificering mogelijk voor downstream screening-applicaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door EV-geassocieerde LC3-II te kwantificeren onder ziekterelevante perturbaties.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanische ontdekking naar preklinische validatie van autofagie-modulerende interventies.
- Biedt een platform voor het evalueren van de extracellulaire verspreiding van pathologische eiwitten in neurodegeneratieve modellen.
Pipeline- en workflowintegratie
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door kwantitatieve, mechanistische readouts van autofagie en EV-biologie mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van de nulhypothese voor doelgenen die de export van LC3-II via EV's reguleren.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve immunoblot-outputs voor vergelijkende analyse tussen verschillende condities.
- Analytiek: Maakt meting van LC3-II en TSG101 mogelijk als orthogonale markers voor pathway- en vesikelspecificiteit.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en ziekte-relevante modellen van eiwitaggregatie en verspreiding.
- Herbruikbaarheid in ondernemingen: Biedt een modulaire workflow die aanpasbaar is aan diverse onderzoeksprogramma's naar autofagie en EV's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets voor autofagie- en EV-paden.
- Operationele waarde: Standardiseert de isolatie van EV's en de kwantificering van LC3-II voor reproduceerbare, schaalbare studies.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen voor neurodegeneratieve targets door mechanistische rollen in eiwitverspreiding te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritisering mogelijk van autofagie-modulerende kandidaten in pijplijnen voor neurodegeneratieve ziekten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, siRNA-transfectie en immunoblotting-technieken.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor hogesnelheids- en ultracentrifugatie voor EV-isolatie.
- Maakt een strikte standaardisatie van monsterbereiding en marker-kwantificering tussen teams noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan verschillende celmodellen, maar optimalisatie kan vereist zijn voor primaire of ziekterelevante systemen.
- Bij de interpretatie van LC3-II en TSG101 output moet rekening worden gehouden met padspecifiteit en experimentele controles.
