Name: Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNAs voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer de dual-color labeling van lange RNA's en inkapseling in fosfolipide vesicles voor single-molecule FRET-TIRF-microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van RNA-dynamica en vouwing mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Tweekleurige eindlabeling en blaasjesinkapseling van RNA's voor smFRET-TIRF-onderzoeken

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
<li>Liu, T., Patel, S., Pyle, A. M. Making RNA: Using T7 RNA polymerase to produce high yields of RNA from DNA templates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+T+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Academic Press. (2023).</li>
<li>Leamy, K. A., Assmann, S. M., Mathews, D. H., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+in+vitro+and+in+vivo+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between in vitro and in vivo RNA folding.</a> Q Rev Biophys. 49, e10(2016).</li>
<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>RNA labeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp;mL DNA LoBind tubes&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC-HCl of EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, No-Weigh Format. Bewaar bij&nbsp; -20 &deg;C</td></tr><tr><td>3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, voor moleculaire biologie, &ge;99.5% (titratie)</td></tr><tr><td>Azijnzuur (glazuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100%, watervrij voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Centrifugeerfiltratie-eenheid&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu;L</td></tr><tr><td>Cyanine5 hydrazide (Cy5-hydrazide)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, CAS-nummer 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Molecuulbiologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absoluut &ge;99,8%</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>voor moleculaire biologie, &ge;99.0%</td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>rookzuur 37%, voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>Natriumacetaat (NaOAc)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>watervrij, ReagentPlus, &ge;99.0%</td></tr><tr><td>Natriummetaperiodaat (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Pierce productlijn</td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 amine (sCy3-amine)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, CAS-nummer 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>Molecuulbiologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Kamervoorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl)triethoxysilaan (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>voor analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotine-polyethyleenglycol-succinimide valeraat (biotine-PEG-SVA, bPEG) en Methoxypolyethyleenglycol-succinimide valeraat (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5.000 en MPEG-SVA, MW 5.000 - Combo Kit</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0.13-0.16&nbsp;mm dikte</td></tr><tr><td>Deconex 11 universeel</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Reinigingsoplossing voor laboratoriumglaswerk</td></tr><tr><td>Diamantgecoate kernboor</td><td>Crystalite Corporation</td><td></td><td>1 mm dikte</td></tr><tr><td>Diamantborer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absoluut &ge;99,8%</td></tr><tr><td>Glazen Coplin-kleefpot met deksel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beeldruimte</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 putjes,&nbsp; 9&nbsp;mm &times; 0.12&nbsp;mm</td></tr><tr><td>Zuurstofplasmareiniger</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>voor moleculaire biologie, &ge;99.0%</td></tr><tr><td>Kwartsglazen</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5&nbsp;x&nbsp;2.5&nbsp;cm, 1 mm dikte</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99.5-100.5%</td></tr><tr><td>Bereiding van lipidecake</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(cap biotinyl) (natriumzout), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>1 jaar stabiel bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-dитеtradecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, C36H72NO8P)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifugebuizen, Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Autoclaveer voor sterilisatie</td></tr><tr><td>500&nbsp;mL Schlenk-kolf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>voor analyse EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oppervlakte-immobilisatie via encapsulatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, voor moleculaire biologie, &ge;99.5% (titratie). Bewaren bij +4 &deg;C in het donker.</td></tr><tr><td>Zelfklevende verzegelingstabs</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>uit runderlever, waterige suspensie, 10.000-40.000 eenheden/mg eiwit</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge;99.5

fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange rna's voor fret-tirf-microscopie met één molecuul

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNA's voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

fluorescent-end-labeling-encapsulation-long-rnas-for-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Deze studie geeft een gedetailleerde experimentele procedure om looping dynamiek van dubbelstrengs DNA meten met behulp van single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Het protocol beschrijft ook hoe de looping kansdichtheid genaamd de J-factor halen.

Het bestuderen van DNA Looping door Single-Molecule FRET

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

De functies van dynamine-superfamilie-eiwitten zijn afhankelijk van conformationele veranderingen in combinatie met GTP-hydrolyse. Een systeem wordt beschreven met behulp van de single-molecule FRET (smFRET) -techniek om de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine in verschillende nucleotide-ladende toestanden te volgen.

Single-molecule FRET-beeldvorming voor het observeren van de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine

Het doel van dit protocol is het mogelijk maken van kwantitatieve fluorescentielevensduurmeting van Riboglow-probes voor reproduceerbare RNA-beeldvormingsworkflows in vitro, in levende zoogdiercellen en in driedimensionale cellulaire modellen. We beschrijven werkprocessen voor monstervoorbereiding, probe-levering, gegevensverzameling en kwantitatieve analyse voor het extraheren van onbevooroordeelde fluorescentielevensduurmetingen.

Karakterisering van Riboglow-probes in vitro als basis voor fluorescentie-levenslange beeldvorming in levende zoogdiercellen en driedimensionale cellulaire modellen

Leer de dual-color labeling van lange RNA's en inkapseling in fosfolipide vesicles voor single-molecule FRET-TIRF-microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van RNA-dynamica en vouwing mogelijk.

Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNA's voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul

Meer video's verkennen