Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNA's voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul

Ons onderzoek richt zich op de dynamiek van katalytische actieve RNA's en hoe deze dynamiek verandert onder verschillende omgevingsomstandigheden. We gebruiken single-molecule FRET om de invloed van factoren zoals monovalente en tweewaardige middellijnen, chaperonne-eiwitten en verdringingsmiddelen op de RNA-dynamiek te bestuderen. Het is een uitdaging om donor- en acceptorfluoroforen nauwkeurig op te nemen zonder de structuur en functie van RNA te verstoren.

Bovendien is het moeilijk om de vouwing van een groot dynamisch RNA te volgen. Het gevestigde etiketterings- en inkapselingsprotocol stelt ons echter in staat om de vouwdynamiek van het functionele RNA in de loop van de tijd te volgen. Ons protocol richt zich op de uitdaging om grote, katalytisch actieve RNA's in realtime en onder neofysiologische omstandigheden te observeren.

Door het RNA en de blaasjes covalent te labelen en in te kapselen, die vervolgens aan het oppervlak worden geïmmobiliseerd, kunnen we de RNA-functie volgen met TIRF met één molecuul. We richten ons op covalente FRET-labeling van lange katalytische RNA's en in het bijzonder groep II-introns. Dit is een uitdaging vanwege hun structurele complexiteit.

Wanneer ingekapseld in blaasjes, kunnen we het RNA binnen het vluchtige veld houden voor TIRF-microscopie, en toch kan het RNA vrij zweven. Op deze manier kan smFRET ongehinderd het dynamische gedrag van RNA blootleggen. We zullen blijven proberen te begrijpen hoe de natuur echt werkt, waarbij we ons richten op de structuur-functierelatie en dynamiek van ribosomen, riboschakelaars en andere regulerende RNA's met behulp van een multi-technische benadering.

In de toekomst zal ons werk dus een belangrijk aandachtspunt vormen in de richting van onderzoek onder fysiologische en cellulaire omstandigheden. Aliquot om te beginnen het RNA van belang, met 50 tot 75 microgram RNA per buis in 55 microliter dubbel gedestilleerd water, en voeg vervolgens 45 microliter van het EDC/NHS-natriumacetaat-pH 6-mengsel toe aan het RNA. Incubeer het mengsel gedurende vier uur bij 25 graden Celsius terwijl het schudt op 500 RPM.

Resuspendeer de geactiveerde RNA-pellet na incubatie in 95 microliter 100 millimolaire MOPS-buffer pH 7,5. Voeg vervolgens vijf microliter twee-millimolair gesulfoneerd cyanine-3-amine toe aan het geactiveerde RNA en incubeer bij 25 graden Celsius gedurende 16 uur bij 500 RPM om de fluorofoor te koppelen aan het geactiveerde 5-prime-fosfaat. Voeg de volgende dag 200 microliter dubbel gedestilleerd water toe om de scheiding te verbeteren.

Zuiver vervolgens het 5-prime fosfaat gelabelde RNA door ethanolprecipitatie. Resuspendeer het gelabelde RNA na zuivering in 100 microliter 100 millimolair tris HCl en incubeer gedurende twee uur bij 25 graden Celsius. Om de vrije kleurstoffen te verwijderen, wast u het gelabelde RNA vervolgens in dubbel gedestilleerd water met centrifugale filtratie.

Voor dual-end-labeling, aliquot het 5-prime end-gelabelde RNA, met ongeveer 50 tot 75 microgram RNA per buisje in 90 microliter oplossing. Voeg vijf microliter éénmolaire natriumacetaatbuffer pH 5,5 toe. Voeg vervolgens vier microliter vers bereide 500-millimolaire natriummetaperiodaatoplossing toe.

Voeg voor 3-prime end single-labeling acht microliter metaperiodaat-voorraadoplossing toe. Nadat de oplossingen twee uur in het donker zijn geïncubeerd, pipetteer je 30 microliter 50%glycerol om de reactie te stoppen. Voeg na 30 minuten incubatie 400 microliter ijskoud ethanol-natriumacetaatneerslagmengsel toe.

Resuspendeer de geoxideerde RNA-pellet in 95 microliter 50-millimolaire natriumacetaatbuffer pH zes. Zuiver het dual-end-gelabelde RNA door ethanolprecipitatie en centrifugale filtratie, zoals eerder aangetoond. Elulaat het gezuiverde RNA in dubbel gedestilleerd water.

Vergelijk visueel de kleuren van het supernatans en de pellets die na elke stap zijn verkregen. Bereken de RNA- en geconjugeerde kleurstofconcentraties op een UV-zichtbare spectrofotometer. Fluorescerende gelelektroforese bevestigde de succesvolle enkelvoudige en dubbele labeling van RNA, zoals blijkt uit de comigratie van het RNA met de fluoroforen.

De FRET-efficiëntie nam toe in aanwezigheid van metaalionen, wat wijst op RNA-vouwing, wat leidde tot een afname van de donoremissie en een toename van de acceptoremissie. Om een microfluïdische kamer voor te bereiden, gebruikt u een diamantboormachine om vier gaten in de kwartsglaasjes te boren om twee kanalen te vormen. Plaats de geboorde kwartsglaasjes en ongeveer twee keer zoveel dekglaasjes in een glazen Coplin-kleurpot met deksel.

Sonificeer de dia's en dekglaasjes gedurende vijf minuten in dubbel gedestilleerd water. Soneer de pot vervolgens gedurende 30 minuten in een 10%laboratoriumglaswerkreinigingsoplossing bij 50 graden Celsius. Nadat je de pot hebt gespoeld met dubbel gedestilleerd water, sonicaat je gedurende 30 minuten in een éénmolaire kaliumhydroxideoplossing en laat je het een nacht in de oplossing staan.

Na herhaaldelijk spoelen en soniceren met gedestilleerd water, droogt u de objectglaasjes en dekglaasjes af met behulp van stikstofgasstroom. Behandel de gedroogde glaasjes en dekglaasjes gedurende 30 minuten met een zuurstofplasmareiniger. Plaats de schone objectglaasjes en dekglaasjes gedurende één minuut in een Coplin-kleurpotje met 3%AP-test ethanoloplossing Sonicate en incubeer vervolgens gedurende 30 minuten.

Spoel de glaasjes en dekglaasjes elk drie keer af met absolute ethanol en dubbel gedestilleerd water en droog ze vervolgens onder stikstofgasstroom. Bereid vervolgens een vochtige doos voor door een lege pipetdoos voor de helft te vullen met dubbel gedestilleerd water. Plaats de objectglaasjes in de doos met de te behandelen kant naar boven.

Voeg druppeltjes van 30 microliter vers bereid bPEG/mPEG-mengsel toe aan het midden van het objectglaasje om beide kanalen te bedekken. Dek de druppel af met een schoon dekglaasje en sluit de vochtige doos. Incubeer de doos een nacht in het donker voor PEGylatie.

Spoel de volgende dag de PEG-gepassiveerde en gebiotinyleerde objectglaasjes en dekglaasjes af met dubbel gedestilleerd water en observeer de verandering in hydrofobiciteit van de behandelde oppervlakken. Bevestig de dubbelzijdige sticker op de dia en zorg ervoor dat de sticker het interessegebied bedekt. Plaats vervolgens het dekglaasje voorzichtig op het glaasje en lijn de gePEGyleerde oppervlakken uit om naar elkaar toe te wijzen.

Breng de geassembleerde kamer over naar een centrifugebuis van 50 milliliter en vul de buis met stikstofgas. Gebruik om te beginnen een steriele naald om van binnenuit een gat in het deksel van een steriele, schone buis van twee milliliter te prikken. Voeg 109 microliter bPE-DMPC-mengsel toe aan de buis.

Plaats een kartonnen celscheidingsinzet uit een opbergdoos voor microbuisjes in een Schlenk-kolf van 500 milliliter om als buishouder te dienen. Plaats met een lang pincet de buisjes met het lipidenmengsel voorzichtig in de buishouder. Verdamp de chloroform een nacht onder een laag debiet stikstofgas.

Na het verkrijgen van de gedroogde lipidenlaag, sluit u de buizen af met parafilm om de gaten af te dekken. Monteer de extruder met behulp van een membraan van 100 nanometer polycarbonaat en een polyester afvoerschijf van 10 millimeter. Breng de spuit en de membranen in evenwicht met een buffer die niet knippert.

Na het mengen van dual-end-gelabeld RNA met anti-knipperende buffer, hydrateert u de lipidencake met RNA anti-knipperende buffermengsel bij 30 graden Celsius. Schud gedurende vijf minuten op 1.400 RPM, gevolgd door 15 minuten op 700 RPM. Centrifugeer het mengsel gedurende twee minuten op 13.000 G en verdun het supernatans met 250 microliter anti-knipperbuffer.

Vul de spuit met de RNA-lipidensuspensie en extrudeer 35 keer bij 30 graden Celsius op een verwarmingsblok om het dual-end-gelabelde RNA in te kapselen in fosfolipideblaasjes met een diameter van 100 nanometer. Spoel de kamer twee keer door met 200 microliter 5X standaard buffer bij kamertemperatuur. Vul de kamer met 50 microliter van 20 microliter streptavidine-oplossing en incubeer gedurende vijf minuten.

Spoel de kamer vervolgens door met 200 microliter standaardbuffer en 100 microliter anti-knipperbuffer. Voeg 75 microliter vesikelsuspensie toe en incubeer gedurende 10 minuten voor immobilisatie van het ingekapselde RNA op het oppervlak. Spoel de kamer na immobilisatie door met 200 microliter vers bereide beeldvormingsbuffer.

Voor gegevensverzameling monteert u de kamer op de TIRF-microscoop en verkrijgt u smFRET-gegevens met afwisselende laserexcitatie. Single-molecule FRET-beeldvorming met behulp van TIRF-microscopie volgde individuele RNA-moleculen en detecteerde real-time veranderingen in FRET-efficiëntie. Dynamische sporen van één molecuul vertoonden anti-gecorreleerde fluctuaties tussen donor- en acceptorsignalen, wat wijst op bevestigende veranderingen in RNA.