Engineering van chimere antigeenreceptor-natuurlijke killercellen die zich richten op schimmelinfecties met behulp van het niet-virale Sleeping Beauty Transposon-systeem

Ons onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een kant-en-klare CAR cellulaire therapie voor invasieve schimmelinfecties. We streven ernaar om de beste doelen, CAR-ontwerpen en combinatie van immuuncellen te identificeren om optimale therapeutische resultaten te bereiken. Recente ontwikkelingen, waaronder ons eigen werk, zijn gericht op de ontwikkeling van CAR T-celtherapieën gericht op Aspergillus fumigatus.

Deze gemanipuleerde cellen hebben veelbelovende resultaten laten zien in preklinische modellen door de schimmelbelasting aanzienlijk te verminderen, de antischimmelimmuniteit te beheersen en de algehele overleving te verbeteren. Momenteel is het meeste onderzoek in het veld gericht op het produceren van CAR T-cellen die specifiek zijn voor een zeer beperkte reeks doelen met behulp van virale vectoren of een transposonsysteem van Doornroosje. De belangrijkste uitdagingen zijn het identificeren van optimale schimmeldoelen en het produceren van een kant-en-klaar cellulair product dat zowel effectief als schaalbaar is voor klinische toepassingen.

Met dit protocol komen we tegemoet aan de behoefte aan kosteneffectieve en schaalbare methoden om niet-virale CAR-NK-cellen te genereren. Het biedt een toegankelijke benadering voor het screenen van nieuwe antischimmeldoelen en biedt een fundamentele stap in de richting van kant-en-klare CAR-NK cellulaire therapie voor schimmelinfecties. Controleer om te beginnen de NK-92-cellen onder de microscoop op clusters op een heldere achtergrond, voeg 2 milliliter celkweekmedium per putje voor elke toestand toe aan een plaat met zes putjes en plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Breng 8 maal 10 over tot de macht van 6 NK-92 cellen op een conische bodembuis van 15 milliliter en centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 200 G met een versnelling en vertraging van 3. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, vult u de buis met de celpellet met maximaal 15 milliliter voorverwarmd PBS en centrifugeert u opnieuw. Piket tijdens het centrifugeren 8 microgram Af-CAR-plasmide-DNA en 4 microgram SB100X-minicirkel in één reactiebuis en houd het DNA van de tweede buis vrij om als schijncontrole te dienen.

Voor het transfectiesysteem voegt u 3 milliliter elektrolytische buffer toe aan de eerste buis en plaatst u deze in het pipetstation. Gooi na het centrifugeren het bovenstaande voorzichtig weg en suspendeer de celpellet in 200 microliter resuspensiebuffer. Voeg vervolgens 100 microliter van de celsuspensie toe aan elk van de twee reactiebuizen en meng voorzichtig.

Pipette het mengsel van de DNA-cel van de eerste reactiebuis gebruikend de pipet van het transfectiesysteem, voegt de transfectiepipet verticaal in de buis in het pipetstation toe. Stel de eerste puls in op 1.650 volt en de pulstijd op 20 milliseconden voordat u op start drukt om de puls te starten. Stel na de eerste puls de tweede puls in op 500 volt en de pulstijd op 100 milliseconden en start de tweede puls.

Zodra de tweede puls is voltooid, verwijdert u de pipet langzaam uit het pipetstation. Breng de cellen onmiddellijk over in een putje van de voorbereide kweekplaat met 2 milliliter voorverwarmd celkweekmedium en beweeg de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer de plaat in een bevochtigde broedmachine bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Voeg na 30 minuten incubatie interleukine-2 toe aan de putjes in een eindconcentratie van 150 internationale eenheden per milliliter. Transfecteer om te beginnen de NK-92-cellen met het gewenste plasmide. Breng de cellen over in een conische bodembuis van 15 milliliter.

Centrifugeer vervolgens de cellen en verdun ze tot een concentratie van 1 tot 2 keer 10 tot de macht 6 cellen per 100 microliter met behulp van de buffer. Voeg 1/3 microliter anti-EGFR-T biotine per 1 keer 10 toe aan de kracht van 6 cellen en meng voorzichtig om ervoor te zorgen dat de oplossing gelijkmatig wordt verdeeld. Incubeer de buis gedurende 25 minuten bij 4 graden Celsius.

Vul na incubatie de buis met maximaal 10 milliliter buffer. Centrifugeer de buis vervolgens gedurende vijf minuten bij 200 G met een versnelling en vertraging van 3 en gooi het bovenstaande na het centrifugeren weg. Voeg vervolgens 8 microliter koudebuffer gevolgd door twee microliter anti-biotine magnetische kralen per 1 keer 10 toe tot de macht van 6 cellen.

Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius. Om de cellen te wassen, vult u de buis met maximaal 10 milliliter buffer en centrifugeert. Na het weggooien van het supernatant, suspendeer je de cellen in 500 microliter buffer.

Plaats een LS-kolom in de max-magneet en was deze met 3 milliliter buffer. Voeg de celsuspensie toe zodra de buffer volledig door de kolom is gemigreerd. Haal de kolom na het wassen uit de magneet en plaats deze in een schone conische bodembuis van 15 milliliter.

Voeg 5 milliliter buffer toe aan de kolom en gebruik de zuiger om de EGF-R-positieve cellen zo snel mogelijk weg te spoelen. De transfectieefficiency na terugwinning bereikte 10 tot 20% en de maximale verrijking verhoogde de celzuiverheid van Af-CAR-NK-92 tot meer dan 95%Om te beginnen, verkrijg verrijkte transgen-tot expressie brengende NK-92-cellen met behulp van magnetisch geactiveerde celsorteertechniek. Bereid vervolgens een Aspergillus fumigatus conidia suspensie voor in een concentratie van 2,5 keer 10 tot de macht 5 conidia per milliliter in het medium.

Doseer 100 microliter van de conidia-suspensie in elk putje van een kweekplaat met 96 putjes en incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 25 graden Celsius. Was op dag twee de nep- en plasmide-getransfecteerde NK-92-cellen twee keer met het medium en voeg 5 keer 10 toe aan de kracht van 4 NK-92-cellen in 100 microliter medium per putje van de plaat met de schimmel om te co-culturen. Incubeer de plaat minimaal 6 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kooldioxide-incubator.

Nadat de plaat gedurende vijf minuten op 300 G is gecentrifugeerd, oogst je 100 microliter supernatans uit elk putje zonder de bodem aan te raken. Breng ten slotte de supernatanten over naar reactiebuizen om ELISA uit te voeren. Af-CAR-NK-92-cellen vertoonden een significant hogere interferon-gammasecretie in vergelijking met nagemaakte NK-92-cellen tijdens co-cultuur met aspergillus fumigatus-kiembuizen.