Microbellen fabriceren en labelen met fluorescerende en radioactieve tracers

Microbubbels zijn met gas gevulde, voor ultrageluid gevoelige deeltjes met unieke mogelijkheden voor beeldvorming en therapie van kanker. Hun evoluerende hulpprogramma's kunnen strategisch worden geavanceerd door applicatiegestuurde traceerbare microbubbels te bouwen. We streven ernaar dit doel te vergemakkelijken door een fabricageprotocol voor lipide-microbubbels te ontwikkelen dat het mogelijk maakt om op maat gemaakte generatie van niet-gelabelde, radioactief gelabelde, fluorescerende en multimodale microbubbels te genereren.

Het bereiken van efficiënte en stabiele radiolabeling met microbellen is een niet-triviale uitdaging. Lipide microbellen zijn kwetsbaar en dus kan het blootstellen ervan aan hitte, tijd en zuiveringsstappen in post-fabricage radiolabelingbenaderingen hun fysisch-chemische eigenschappen en stabiliteit verstoren. Aan de andere kant vereist prefabricage radiolabeling gespecialiseerde apparatuur en een verhoogde blootstelling aan straling.

We overwinnen deze uitdagingen door een nieuw hybride protocol te ontwikkelen waarin radio-isotopenchelatie plaatsvindt vóór de activering van microbellen, maar na de vorming van lipidensuspensie. Deze eenpansbenadering maakt voor het eerst een zeer efficiënte, zuiveringsvrije microbellenradio-etikettering mogelijk die de fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes behoudt. Een belangrijk bijkomend voordeel is de veelzijdigheid van de protocollen. Het kan worden opgenomen tijdens de fabricage van microbellen op maat en worden aangepast aan voorgevormde microbellenlipidensuspensies zoals die in de handel verkrijgbaar zijn. Het kan met succes worden toegepast in verschillende samenstellingen van microbubbellipiden en chelatoren en kan dienovereenkomstig op maat gemaakte radioactieve, fluorescerende of trimodale microbubbels genereren.

Samen maken deze eigenschappen multimodale representatieve tracering van microbubbellipideschalen mogelijk die mechanistische inzichten kunnen bevorderen en de vooruitgang van op microbubbels gerichte ultrasone therapieën in vele domeinen kunnen ondersteunen, waaronder farmacokinetisch onderzoek naar microbellen, multimodale beeldvorming, behandelplanning en het mogelijk maken van synergetische therapieën.

[Verteller] Om te beginnen met het gebruik van een micropipet, voegt u een milliliter AA-PGG-oplossing toe langs de randen van de microbellenlipidefilm naar keuze in een injectieflacon, om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Bedek de opening van de injectieflacon gedeeltelijk met de dop en laat voldoende ruimte over om de perfluoropentaan- of PFP-leiding in te brengen. Laat PFP gedurende 20 seconden boven de vloeistof in de kopruimte van de injectieflacon stromen en sluit de injectieflacon af. Dompel de onderste helft van de injectieflacon gedurende één minuut onder in een waterbad van 70 tot 80 graden Celsius. Sonificeer vervolgens de injectieflacon gedurende 30 seconden in een sonicator voor baden van 69 graden Celsius. Veeg de injectieflacon na sonicatie af en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Vul de kopruimte van de injectieflacon bij met PFP-gas. Sluit vervolgens de injectieflacon af en sluit de randen af met Parafilm. Om een waterbad van 60 graden Celsius in een kristalliserende schaal op te zetten, plaatst u een magnetische roerstaaf in de schaal en plaatst u deze op een temperatuurgeregelde hete roerplaat. Steek een thermische sonde in het water om de temperatuur te controleren en pas de roersnelheid aan om een zwakke maar zichtbare trechter te creëren. Breng met een tang een verzegelde injectieflacon met koper 64 in de vorm van koperchloride in 0,1 normaal zoutzuur over naar een dosiskalibrator. Noteer de koperactiviteit 64 en de tijd. Verwijder met een tang de injectieflacon uit de dosiskalibrator en plaats deze in een loden container. Om de waarde in megabecquerel per milliliter te berekenen, deelt u de activiteit die op de dosiskalibrator wordt genoteerd door het volume koper 64. Verwijder de dop van de lipidensuspensie en zet deze vast in een injectieflaconhouder. Verwijder vervolgens de dop van de koperen injectieflacon 64 en pak de injectieflacon vast met een tang. Breng met behulp van een micropipet een hoeveelheid koper 64-oplossing die overeenkomt met 40 tot 250 megabecquerel activiteit over in de lipidensuspensie. Draai met een platte tang met rubberen punt de radioactieve lipidensuspensie minstens vijf keer op en neer om de koper 64 in de suspensie te mengen. Terwijl de injectieflacon met de goede kant naar boven staat, tikt u voorzichtig tegen de dop terwijl u de injectieflacon stabiliseert. Verwijder de dop voorzichtig gedeeltelijk en breng een PFP-lijn met naald in. Vul de injectieflacon gedurende 20 seconden met PFP. Sluit vervolgens de injectieflacon af en sluit deze af met parafilm. Meet de activiteit van de injectieflacon met behulp van een dosiskalibrator en noteer de tijd. Plaats vervolgens de injectieflacon in een schuimfleshouder zodat de onderste helft van de injectieflacon wordt blootgesteld aan hitte. Dompel de houder onder in het roerwaterbad van 60 graden Celsius en verwarm gedurende een uur. Ondertussen, om de iTLC-strips voor te bereiden, snijdt u microvezelchromatografiepapier in reepjes. Verwarm de reepjes in een glazen droogoven van 80 graden Celsius om ze te activeren. Haal na een uur de injectieflacon uit het waterbad en veeg de randen af met tissuepapier. Draai de injectieflacon op en neer met behulp van een pincet met rubberen punt. Terwijl de injectieflacon rechtop staat, tikt u de dop terwijl u de injectieflacon stabiliseert. Verwijder de parafilm en veeg rond de dop om eventueel ingesloten water te verwijderen. Spot een tot twee microliter van de lipidensuspensie op een centimeter van het onderste midden van een geactiveerde iVRC-strip. Laat de plek drogen. Voeg met behulp van een micropipet 200 microliter iTLC-eluent toe aan de bodem van een reageerbuisje van 10 milliliter. Plaats de buis in een loden container. Voeg de gevlekte iVRC-strip toe aan de buis en laat deze zich ontwikkelen tot de waterval ongeveer een centimeter vanaf de bovenkant van de strip bereikt. Verwijder vervolgens met een tang de ontwikkelde strip en houd deze verticaal. Snijd de strip in drieën over gammateller compatibele plastic buizen van vijf milliliter. Steek de drukdoppen in de buizen. Meet de strip met buizen en een lege regelbuis met behulp van een gammateller om koper 64-activiteit te detecteren. Registreer de tellingen per minuut en trek de activiteit van de stuurbuis af van de andere metingen om te corrigeren voor achtergrondstraling. Bereken vervolgens de radiochemische zuiverheid op basis van de gecorrigeerde tellingen per minuut. Verwijder vervolgens de dop van de radiografisch gelabelde injectieflacon met lipidensuspensie en voeg 8,89 microliter van een normaal natriumhydroxide toe aan de suspensie. Tik na het afdekken en draaien van de injectieflacon zachtjes op de injectieflacon om de ingesloten suspensie in de dopruimte te verwijderen en vul de kopruimte met PFP-gas. Plaats de injectieflacon op een mechanische schudder en activeer deze gedurende 45 seconden bij 4.530 tpm om een melkachtige microbellensuspensie te genereren. Bij passief afkoelen tot kamertemperatuur, keert u de injectieflacon voorzichtig om om de microbellensuspensie opnieuw te suspenderen. Plaats de injectieflacon op een vlakke ondergrond en wacht twee minuten. Rust ondertussen een plastic spuit van één milliliter uit met een naald van 18 gauge en ontlucht de spuit door lucht op te zuigen en in en uit te spuiten. Verwijder na twee minuten snel de dop van de injectieflacon en zuig 400 tot 550 microliter van de suspensie van de bodem van de injectieflacon. Veeg de randen van de naald voorzichtig af en breng de microbellensuspensie over in een microcentrifugebuis. Meet na het afsluiten van de buis de activiteit van het uiteindelijke microbellenproduct op een dosiskalibrator en noteer de tijd. Deel de activiteitswaarde door het gedecanteerde volume om de activiteit in megabecquerel per milliliter te verkrijgen. Voeg om te beginnen 10 tot 200 microliter van de microbellensuspensie toe aan een centrifugefiltereenheid van 0,5 milliliter met een molecuulgewicht van 30.000 molecuulgewicht in een compatibele microcentrifugebuis. Centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 12.000 G. Gebruik vervolgens een schaar om de verbinding tussen de microcentrifugebuis en de dop door te knippen. Plaats de dop in een scintillatieflacon van 20 milliliter met het label CAPS. Breng de filtereenheid over naar een nieuwe microcentrifugebuis met het label TUBE 2. Plaats de eerste microcentrifugebuis met infranatans in een scintillatieflacon van 20 milliliter met het label TUBE 1. Voeg 200 microliter dubbel gedestilleerd water toe aan de filterunit in TUBE 2. Centrifugeer de filtereenheid opnieuw bij 12.000 G gedurende 10 minuten. Voeg na de laatste overdracht van de filtereenheid 200 microliter gedestilleerd water toe aan de filtereenheid in TUBE 3 en centrifugeer. Snijd na het centrifugeren de dop van de buis af, voeg deze toe aan de scintillatieflacon met dop en breng de filtereenheid over in een nieuwe scintillatieflacon van 20 milliliter met het label UNIT. Plaats TUBE 3 in een nieuwe glazen scintillatieflacon van 20 milliliter. Sluit de vijf scintillatieflacons af en maak een lege en afgedekte scintillatieflacon klaar als blancocontrole. Meet de zes scintillatieflesjes op een gammateller om koper 64-activiteit te detecteren. Trek de blanco-controle af van de andere metingen van de injectieflacon. Bereken de radio-etikettering of chelatie-efficiëntie.