Vooruitgang in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide chimere antigeenreceptor-expressie natuurlijke killercellen

De reikwijdte van ons onderzoek richt zich voornamelijk op de ontwikkeling van menselijke iPSC CAR NK-cellen met verbeterde antitumoractiviteit en in-vivo persistentie om diverse kwaadaardige aandoeningen beter te behandelen. Met dit nieuwe CAR iPSC NK-generatieprotocol willen we antwoord geven op de vraag hoe deze cellen de micro-omgevingsresistentie van tumoren kunnen overwinnen en de werkzaamheid kunnen verbeteren en een veilige en schaalbare productie kunnen garanderen. De belangrijkste experimentele uitdagingen bij de ontwikkeling van iPSC-afgeleide CAR NK-cellen zijn onder meer het bereiken van consistente en efficiënte differentiatie van iPSC in functionele gevallen, het waarborgen van stabiele CAR-expressie zonder nadelige effecten en het verbeteren van in-vivo persistentie.

Bovendien worden onderzoekers geconfronteerd met uitdagingen op het gebied van schaalbaarheid, immuunafstotingen en regelgevende houders voor klinische toepassingen. We hebben het iPSC-afgeleide CAR NK-celonderzoek aanzienlijk bevorderd door efficiënte niet-virale CAR-genintegratie tot stand te brengen met behulp van op transposon gebaseerde genmodificaties. Daarnaast hebben we CRISPR-Cas9 op iPSC-niveau geoptimaliseerd om immuuncontrolepunten te verwijderen, TMA-factoren om de werkzaamheid van cellen en tumoren en in-vivo persistentie in solide tumormodellen te verbeteren en casussen.

Met ons protocol dat gebruikmaakt van niet-virale piggyback-vector gemedieerde CAR-genexpressie, streven we ernaar de kloof te dichten voor de ontwikkeling van veilige, efficiënte en schaalbare genmodificatie voor iPSC CAR NK-cellen, deze methode vermindert het risico op insertionele mutagenese verbetert de reproduceerbaarheid en kosteneffectiviteit van het genereren van CAR NK-cellen voor kankerimmunotherapie. In de toekomst zal ons laboratorium zich richten op de ontwikkeling van nieuwe gemanipuleerde iPSC-afgeleide NK-cellen die gericht zijn op immuuncontrolepunten. We zullen ook onderzoeken hoe verschillende micro-omgevingsfactoren van tumoren kunnen worden aangepakt door bispecifieke of trispecifieke antilichamen te gebruiken om de specificiteit in vivo persistentie en antitumoractiviteit te verbeteren.

Om te beginnen met het spinnen van het embryolichaam of de EB-vormingspassage, ongeveer 200.000 gemanipuleerde CAR iPSC's per put in een voorgecodeerde plaat met zes putjes in een voorgecodeerde plaat met zes putjes in de basaalmembraanmatrix met MT-overschot, incuberen de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide, na twee dagen het kweekmedium verwijderen en de cellen losmaken door gedurende vijf minuten te incuberen met een milliliter voorverwarmde TrypLE Select bij 37 graden Celsius. Dissocieer vervolgens voorzichtig de celaggregaten tot een enkele celsuspensie en breng de suspensie over in een conische buis van 15 milliliter. Voeg drie milliliter PBS toe om de dissociatiereactie te stoppen.

Suspendeer vervolgens de cellen opnieuw in MK SR-plus medium en filtreer ze door een celzeef van 70 micrometer om aggregaten te verwijderen. Centrifugeer de cellen. Was de pellet met vijf milliliter PBS en suspendeer ze vervolgens opnieuw in één milliliter EB-vormingsmedium.

Verdun de cellen na het tellen tot de juiste dichtheid met behulp van een EB-vormingsmedium dat cytokines en 10 micromolaire ROCK-remmer bevat. Met behulp van een meerkanaals pipet worden 3000 tot 10.000 cellen per putje in 100 microliter EB-media in een plaat met 96 putjes geplaatst. Centrifugeer de cellen vijf minuten bij 300 G en incubeer gedurende zes dagen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Om de lichaamskwaliteit van het embryo te controleren, bereidt u eerst vier milliliter voorverwarmde 0,25% trypsine met 0,4% kippenserum voor het dissociëren van de EB's. Breng na zes dagen 10 tot 30 EB's over in een conische buis van 15 milliliter. Voeg trypsine-kippenserumoplossing toe aan de EB's en incubeer ze in een waterbad.

Vortex van de EB's tijdens dissociatie om de drie tot vijf minuten gedurende 10 minuten. Pipetteer de getrypsiniseerde EB's en meng ze meerdere keren op en neer om een grondige dissociatie te garanderen. Voeg vervolgens vijf milliliter PBS toe om het trypsinisatieproces te stoppen.

Filtreer de celoplossing door een celzeef van 70 micrometer in een nieuwe conische buis. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 300 G en suspendeer de pellet opnieuw in drie tot vijf milliliter verse EB-media. Kleurt de cellen na het tellen met typische EB-markers.

Voeg het aanbevolen volume antilichamen toe aan elke buis met gedissocieerde afzonderlijke cellen van EB in 100 microliter stroombuffer en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Was de cellen na incubatie twee keer met stroombuffer. Voeg SYTOX blauwe levende dode vlek toe en analyseer met behulp van flowcytometrie-analyse.

Begin met het coderen van elk putje van een plaat met zes putjes met vijf tot 10 microliter van een 2% gesteriliseerde gelatineoplossing. Incubeer de plaat twee tot vier uur bij 37 graden Celsius. Zuig na de incubatie de resterende gelatineoplossing op en voeg drie milliliter van de natuurlijke moordenaar of het NK-differentiatiemedium met cytokines toe aan elk putje van de met gelatine beklede plaat met zes putjes.

Breng vervolgens met behulp van een pipet van één milliliter voorzichtig spin-EB's over die zijn afgeleid van gemanipuleerde CAR iPSC's naar een schaal van 10 centimeter. Voeg drie milliliter NK-differentiatiemedium met cytokinen toe aan elk putje van de plaat met zes putjes. Met behulp van een micropipet van één milliliter worden 16 tot 20 EB's in elk putje van de plaat met zes putjes verdeeld en gedurende drie tot vier weken bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide geïncubeerd.

Evalueer na incubatie de expressie van NK-celmarkers CD45-positief en CD56-positief door middel van flowcytometrie op suspensiecellen. Wanneer meer dan 80% van de suspensiecellen CD45 positief en CD56 positief tot expressie brengt. Oogst de cellen door ze door een filter van 70 micrometer te leiden om klonten te verwijderen.

Voorafgaand aan het co-kweken van kunstmatige antigeenpresenterende cellen of kunstmatige APC's in NK-cellen, bestraalt u de kunstmatige APC's met 100 grijs en bewaart u ze als bevroren stengels. Kweek ze na het oogsten van NK-cellen met een dichtheid van vijf keer 10 tot de macht van vijf cellen per milliliter in NK-expansiemedium aangevuld met 50 eenheden per milliliter Interleukine-2 en Interleukine-15. Voeg dooi bestraalde kunstmatige APC's toe aan de NK-cellen in een verhouding van één op één en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Zet om te beginnen de flowcytometer aan. Evalueer de expressie van de NK-activeringsreceptor op de anti-GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen om de celactiviteit en rijpingsstatus van het carcase-geval te bepalen. Voor de Caspase-3/7 testen.

Tel de doelcellen in GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen en kleur ze voor met CellTrace Violet-kleurstof in een eindconcentratie van vijf micromolair in PBS onder lichtbescherming gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Was de kleuringsdoelcellen in een compleet kweekmedium Vóór co-cultuur met CAR iPSC-afgeleide NK-cellen in verschillende effector-tot-doelverhoudingen bij 37 graden Celsius. Na drie uur en 30 minuten co-cultuur.

Voeg Caspase-3/7 groen detectiereagens toe en incubeer nog eens 30 minuten. Voeg SYTOX dode cel kleuringsoplossing toe tijdens de laatste vijf minuten van de kleuring en meng voorzichtig. Analyseer de gekleurde cellen met behulp van flowcytometrie.

De vorming van spin-EB's uit GPC3 CAR-gemanipuleerde IPC's werd waargenomen op dag zes. Bevestiging van vroege differentiatie. Gedifferentieerde natural killer- of NK-cellen van GPC3 CAR IPC's vertoonden verschillende morfologie in verschillende stadia van dag drie tot dag 28.

Flowcytometrische analyse toont de expressie van hematopoëtische antigenen CD34 en CD31 aan, evenals een kleine hoeveelheid CD43, maar nog niet tot expressie komend CD45 in zowel wildtype als GPC3 CAR iPSC's afgeleide spin EB's op dag zes. In casusspecifieke markers werden gedetecteerd in volwassen wildtype in GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen op dag 35. Bevestiging van succesvolle differentiatie in NK-cellen.

Geëxpandeerde wildtype en anti GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen vertoonden verschillende activeringsmarkers, wat de rijping van NK-cellen aantoont. GPC3-antigeenexpressie werd bevestigd op tumorcellijnen met behulp van flowcytometrie, waarbij de doelspecificiteit voor anti-GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen werd gevalideerd. Anti GPC3 CAR iPSC-afgeleide NK-cellen vertoonden een hogere cytotoxische activiteit tegen GPC3-cellijnen die HepG2-, SNU-449-, CAL 27- en SKOV3-cellijnen tot expressie brengen in vergelijking met wildtype iPSC NK-cellen.