Spirometrie met hoge resolutie in een kamer met een klein volume

In deze studie willen we onderzoeken of de kleine volumekamer die is gekalibreerd op 0,5 milliliter kan worden gebruikt in respirometrische tests zonder afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid die wordt verkregen voor het klassieke volume van twee milliliter in het Oroboros-platform.

Onze ontwikkeling van de kamer met klein volume en evaluatie door middel van respirometrie met hoge resolutie en strenge kwaliteitscontrole met behulp van nauwkeurige OXPHOS-analyse maakte de weg vrij voor ontwikkelingen, nieuwe innovaties, dat wil zeggen, nummer één, een 12-kamer O2k-respirometer, nummer twee, een robot voor automatische titraties van stoffen in complexe protocollen die worden toegepast voor OXPHOS-analyse. Deze toepassingen zullen cruciaal zijn bij de verdere uitbreiding naar mitochondriale analyse, diagnose van mitochondriale ziekten, evaluatie van medicijnontwikkelingen, gericht op zowel de voordelen van de geneesmiddelen voor de mitochondriale functie als op off-target effecten die de mitochondriale functie onvrijwillig verstoren. Toen mijn team meer dan 30 jaar geleden respirometrie met hoge resolutie ontwikkelde, was er een paradigma dat mitochondriën, mitochondriën, mitochondriën. Misschien was er een verschil tussen spier- en levermitochondriën, maar dat was het dan. Niemand was echt geïnteresseerd in mitochondriën buiten deze paradigma's. Met onze protocollen die zijn ontwikkeld voor respirometrie met hoge resolutie, hebben we een enorme diversiteit aan mitochondriale functies aangetoond. Dat stelt ons in staat om mitochondriale ademhalingscontrole in verschillende celtypen, weefsels en soorten met een nieuw oog te evalueren. 30 jaar geleden waren er ongeveer 10 publicaties die dit op prijs stelden. Nu hebben we met ons instrument meer dan 1.500 die deze protocollen gebruiken.

Er is vier keer minder monster nodig in de kamer met een klein volume in vergelijking met de klassieke kamer van twee milliliter. In het geval van een monster met een lage ademhalingsfrequentie, kan dezelfde hoeveelheid monster worden gebruikt om het volume specifieke zuurstoffluxen te verhogen om de onzekerheid van de meting te verminderen.

De focus van ons werk in het Oroboros R&D Laboratorium is het combineren van instrumentele ontwikkeling en academisch onderzoek. We evalueren mitochondriale ademhalingsfunctie en biogenetische profileringen met multi-sensoranalyse. Dat is het meten van ademhaling, redoxpotentialen, membraanpotentiaal, calciumopname, waterstofperoxideproductie en verschillende andere parameters die ons in staat stellen een dieper inzicht te krijgen in het biogenetische profiel en de mitochondriale functie en disfunctie.

[Verteller] Monteer om te beginnen de Small Volume, of SV-kamer, op de Oroboros. Schakel vervolgens de Oroboros in en klik op Verbinden om de Oroboros te verbinden met de DatLab-software. Nadat u de kamers volledig hebt gedroogd, voegt u met een pipet 0,54 milliliter water toe aan de SV-kamer. Schakel vervolgens de roerstaafjes in. Voordat u de kamer sluit, bevochtigt u de O-ringen van de stoppen en houdt u het capillair droog. Maak de volumekalibratiering los en steek de stop vervolgens naar beneden totdat de vloeistof de stop capillair vult en er zich een meniscus vormt in de houder aan het bovenste capillaire uiteinde. Draai de volumekalibratiering vast om deze op zijn plaats vast te zetten, zodat het gekalibreerde volume consistent is voor opeenvolgende invoegingen. Vul om te beginnen de kamers met het ademhalingsmedium MiR05 Start de DatLab-software. Selecteer het juiste protocol voor de instrumentele achtergrondtest. Stel de roerrotatiesnelheid in op 550 RPM, het kamervolume op 0,5 milliliter, het interval voor gegevensregistratie op twee seconden en de experimentele temperatuur op 37 graden Celsius. Voer de roerdertest en de luchtkalibratie uit. Stel de R1-markering in op de grafiek voor zuurstofconcentratie door de cursor te verplaatsen terwijl u de Shift-toets ingedrukt houdt. Voer af en toe zuurstofloze kalibraties uit. Bereid tijdens de luchtkalibratie een verse natriumdithionietstockoplossing voor door het O2-Zero-poeder op te lossen in een fosfaatbuffer van 50 millimolair tot een concentratie van 2.5 millimolair voor de SV. Sluit de kamer na het voltooien van de luchtkalibratie. Bewaak het zuurstofsignaal gedurende ongeveer 60 tot 120 minuten, waardoor de zuurstofconcentratie kan afnemen van luchtverzadiging tot ongeveer 150 micromolair. Plaats vier markeringen met het label J01 tot J04 op de negatieve grafiek van de zuurstofhelling. Optioneel titreer met behulp van een Hamilton-spuit de natriumdithionietoplossing om de zuurstofconcentratie aan te passen tot 100 micromolair en stel het merkteken J05 in. Als u de instrumentele zuurstofachtergrondhelling in DatLab wilt berekenen, selecteert u Fluxhelling. Open vervolgens het venster voor zuurstofachtergrondcorrectie en selecteer Actief bestand als bron van de zuurstofachtergrondgegevens. Controleer of alle J0-markeringen worden gebruikt voor de berekening van de lineaire regressie. Klik vervolgens op Toepassen voor de zuurstofachtergrondcorrectie. Was om te beginnen de Oroboros-kamers met gedeïoniseerd water en voeg vers MiR05-medium toe aan de kamer. Open na de instrumentele achtergrondtest een nieuw DatLab-tabblad en selecteer het SUIT-003-protocol voor experimenten met menselijke bloedplaatjes. Selecteer met behulp van het DatLab-protocoloverzicht dat wordt weergegeven in de zijbalk van het protocol de chemische voorraadoplossingen. Selecteer vervolgens de Hamilton-spuiten op basis van de chemicaliën. Plaats de spuiten op het spuitrek met labels in volgorde volgens het SUIT-protocol. Bereken voor gedeeltelijke volumevervanging het volume V dat gelijk is aan het volume V dat is verwijderd van het werkelijke volume in de open kamer, rekening houdend met het capillaire dode volume. Verwijder vervolgens de volledig ingestoken stop en plaats deze op het rek. Verwijder het berekende volume V uit MiR05 uit de kamer op basis van het celtype en de concentratie van de stockcelsuspensie. Pipetteer nu een equivalent volume van de voorraadcelsuspensie met een bekende celconcentratie in de kamer. Voor een volledige volumevervanging daarentegen hevelt u het hele medium van de kamer af. Voeg 0,54 milliliter van de voorraad geïsoleerde cardiale mitochondriën toe aan de SV-kamer. Sluit de kamer en hevel overtollige monsteroplossing over uit de stophouder. Als u een SUIT-protocol voor het starten van een Substrate Uncoupler Inhibitor Titratie (SUIT-protocol) wilt starten, opent u het gebeurtenisvenster in DatLab om de titratievolumes te visualiseren. Titreer met behulp van de Hamilton-microspuit de chemische voorraadoplossingen in de kamer. Stel vervolgens het evenement in DatLab in. Houd rekening met de stabilisatie van de flux na de titratie. Stel voor gegevensanalyse een markering in op het representatieve en stabiele deel van het perceel. De achtergrondzuurstofflux bij luchtverzadiging was 3,9 keer hoger in de kamer van 0,5 milliliter in vergelijking met de kamer van 2,0 milliliter, in overeenstemming met het theoretisch verwachte viervoudige verschil in volumespecifieke achtergrondzuurstofflux. De variabiliteit van instrumentale achtergrondfluxen was bijna identiek in de twee kamervolumes. De ademhalingsfrequentie van levende bloedplaatjes, gepermeabiliseerde fibroblasten en geïsoleerde mitochondriën was nauw gecorreleerd in beide kamertypen wanneer de juiste achtergrondcorrectie werd toegepast. De zuurstofflux stabiliseerde sneller in de kamer van twee milliliter dan in de kamer van 0,5 milliliter na reoxygenatie. Het resterende zuurstofverbruik na remming van Complex III was consistent tussen de twee kamers, in lijn met de instrumentele detectielimiet.