Name: De voorbereiding van Gene Gun Bullets and biolistische Transfectie van Neuronen in Slice Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Leer biolistische transfectie van neuronen in hippocampale slicecultures met DNA-gecoate gouden kogels. Deze methode maakt efficiënte transfectie van specifieke neuronen mogelijk met een schone achtergrond voor visualisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag naar Mark Lucanic en Hwai-Jong Cheng bedanken voor hun hulp met het verwerven van de lage vergroting beelden van de hele hippocampus plakken in deze video. Wij zouden ook graag Sarah Parrish bedanken voor het helpen met de tekst bij de video.

PROTOCOL VOOR biolistische Transfectie Het maken van kogels Kogels zijn goed voor maximaal 6 maanden, maar kan beginnen in de transfectie-efficiëntie afname na 2-3 maanden. Kogels moeten worden bewaard bij 4 ° C in de aanwezigheid van droogmiddel pellets. Altijd laten de scintillatieflesjes, waarin de kogels worden opgeslagen, opwarmen tot kamertemperatuur voor het openen van de flacon. Voordat u begint zijn klaar: <ul><li> Spermidine (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100%-high grade-ongeopende fles) </li><li> Geautoclaveerd H 2 0 </li><li> DNA getransfecteerd worden </li><li> Polyvinylpyrrolidon (PVP-20 mg / ml voorraad) </li><li> 2 X 15 ml conische (2/bullet set) </li><li> Buis (gesneden in een X ~ 30 inch / bullet set) </li><li> Scintillatieflesjes (1/bullet set) </li><li> Verdroging pellets </li><li> 10 ml spuit w / buizen op het einde </li></ul> Bereid slangen: <ol><li> Droge ~ 30 inch van buis (ongeveer 2 cm verder reikt dan rechts O-ring) in de slang station w / N 2 gas (0,4 druk) gedurende een minimum van 20 minuten. </li></ol> Neerslaat DNA op goud kralen: <ol><li> Bereid je DNA te worden getransfecteerd in 50 μmL totale volume in microcentrifugebuis (maximaal 50 ug totaal DNA) </li><li> Weeg 6-8 mg van goud en transfer naar een microcentrifugebuis </li><li> Voeg 100 ul van 0,05 M spermidine aan goud en ultrasone trillingen gedurende 20 sec </li><li> Voeg de 50 ul van DNA naar de goud / spermidine </li><li> Vortex (ongeveer instelling 5) w / kap te openen </li><li> Voeg druppelsgewijs 100 ul van 1 M CaCl 2 </li><li> Ultrasone trillingen kort (&lt;5 sec) </li><li> Laat neerslag gedurende 10 min bij kamertemperatuur </li><li> Ultrasone trillingen kort </li></ol> Bereid PVP-oplossing tijdens de ultrasoonapparaat: <ol><li> Maak verdunnen PVP-oplossing in 15 ml conische, 3.5ml verdund PVP voor elke set van kogels (voeg 7,5 pi van 20mg/ml PVP voorraad tot 3,5 ml 100% EtOH) </li></ol> Spoelen gouden kralen met EtOH: <ol><li> Spin down gouden kralen op volle snelheid voor 10 sec in microcentrifuge </li><li> Gooi supernatant, maar houd een kleine hoeveelheid vloeistof op de top van gouden kralen </li><li> Was 3X met 1 ml EtOH, kort met ultrasone trillingen elke keer, indien nodig, </li></ol> Resuspendeer goud / DNA in PVP-oplossing: <ol><li> Resuspendeer de gouden pellet in 200 pi van de 3,5 ml verdund PVP / EtOH-oplossing </li><li> Vortex het goud pellet om opnieuw in suspensie (kort met ultrasone trillingen indien nodig) </li><li> Breng de 200 pi van de goud / PVP-oplossing om een ​​nieuwe 15 ml conische </li><li> Ga op deze manier, het toevoegen van 200 pi van PVP in een tijd totdat al het goud is overgedragen aan de 15 ml conisch, en het uiteindelijke volume is 3,2 ml </li></ol> Coating slangen: <ol><li> Schakel N 2 op de buis station en verwijder de gedroogde slangen </li><li> Bevestig de gedroogde slang aan de 10 ml spuit </li><li> Schud de 15 ml conische gevuld met goud / PVP </li><li> Plaats het uiteinde van de slang in goud / PVP-oplossing en zuigen langzaam en voorzichtig om luchtbellen te vermijden </li><li> Laat ~ 2 centimeter droog aan beide uiteinden van de buis </li><li> Met de slang nog aan spuit en gevuld met de goud / PVP-oplossing, plaatst u voorzichtig de slang terug in het station </li><li> Markeer de uiteinden van de buis waar de oplossing zit </li><li> Laat het goud voor 5 min te regelen met de spuit bevestigd </li><li> Suck-up de oplossing heel langzaam door te trekken de spuit, zodat de vaste goud blijft achter (zorg ervoor dat u back-wash) </li><li> Koppel spuit </li><li> Draai 90 ° en laat zitten twee seconden </li><li> 180 ° draaien en laat zitten nog 2 seconden </li><li> Draai buis voor 5 sec </li><li> Zet de N 2, zodat de klep leest tussen de 0,4 tot 0,5 en spin de goud gecoate buizen tijdens het drogen gedurende 5 minuten. </li></ol> Snijden slangen: <ol><li> Verwijder de slang van de buis prep-station en snijd de uiteinden bij de merken. </li><li> Zet een label scintillatieflesje onder de slang helikopter te snijden cartridges te vangen </li><li> Plaats buizen in de slang chopper en snijd de slang met schoon scheermes </li><li> Plaats een verdroging pellets in scintillatieflesje </li><li> Bewaar cartridges bij 4 ° C </li></ol> Schieten Tissue Slices Bij het fotograferen gekweekte plakken, is het belangrijk om een ​​relatief steriele techniek gebruiken om besmetting te voorkomen. Vergeet niet dat bij het opnemen van twee verschillende constructen, beide reeksen kogels kunnen worden geladen in dezelfde cartridge houder, maar het vat-liner en het scherm moet worden veranderd tussen de constructen. Voordat u begint zijn klaar: <ul><li> DNA bullets (laten scintillatieflesje opwarmen tot kamertemperatuur voordat u deze opent) </li><li> Weefsel plakken </li><li> Helios Gene Gun </li><li> Helium tank met gen pistool slang &lt;/ Li&gt; <li> Patroonhouder </li><li> Vat liner met kunststof O-ring op zijn plaats </li><li> Diffuser (gewijzigd) </li><li> Diffuser Screen </li><li> Pincet </li></ul> Prepping het gen gun: <ol><li> Met behulp van een tang plaats het goud gecoate plastic patronen in de patroonhouder. </li><li> Plaats de cartridge houder in het gen pistool door eerst het terugdringen van sluis </li><li> Bevestig de patroonhouder met slot </li><li> Verkrijgen van een vat liner met een O-ring en de diffuser scherm stevig op zijn plaats </li><li> Schroef de barrel-liner in het gen pistool </li></ol> Schieten gekweekt plakjes met het gen pistool: <ol><li> Zet oorkappen </li><li> Steek het gen pistool in de slang aangesloten Helium gas tank </li><li> Zet druk op de tank tot 180 PSI </li><li> Schiet een leeg in de lucht om stof of vuil uit de diffusor scherm te verwijderen. Om het pistool schieten, eerst druk van de veiligheid vergrendeling knop ingedrukt totdat het pistool piept, trek vervolgens de trekker over. </li><li> Na de opname van de lege, verwijder de plakjes uit de incubator </li><li> Advance pistool om eerst te bouwen </li><li> Schieten met de diffuser-scherm ongeveer 0,5 - 1 inch van de slice </li><li> Vooraf de cartridge tussen de putten. </li><li> Na de opname van de laatste goed, terug te plaatsen de plakjes in de incubator </li><li> Schakel gas en laat de druk Voordat u het geweer van de Helium slang </li><li> Schroef het vat liner, en verwijder de cartridge en de gebruikte schalen </li></ol> Reinigingscartridge houders en vat liners: <ol><li> Plaats cartridges, vat liners, en diffuser schermen in een bekerglas met water en zeep </li><li> Plaats beker in bad ultrasoonapparaat en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten </li><li> Grondig afspoelen met water tot alle zeepresten verwijderd zijn </li><li> Soak in 70% EtOH voor een uur </li><li> Plaats op droog papier handdoek &#39;s nachts om te drogen </li><li> Schoon cartridges, vat liners, en schermen kunnen worden hergebruikt in de daaropvolgende biolistische transfecties </li></ol> Trouble shooting tips voor biolistische Transfectie Biolistische transfectie kan soms resulteren in een suboptimale transfectie omstandigheden. Het kan leiden tot te weinig of te veel cellen getransfecteerd, te hoge of te lage expressie niveaus, of kan leiden tot weefsel plakjes te worden over het algemeen ongezond. Vaak ongezonde plakjes gevolg van de druk ontploffing. Hier zijn enkele tips om optimaal te getransfecteerde weefsel plakjes te verkrijgen. Als plakjes lijken te zijn ongezond (of als er te veel cellen worden getransfecteerd / slice), probeer dan: <ul><li> toenemende opnameafstand </li><li> afnemende druk op de gas tank </li><li> het verminderen van de hoeveelheid goud </li><li> uitsnijden van het centrum van de Bio-Rad diffuser en het vervangen van het centrum met een diffuser scherm. </li></ul> Als er te weinig cellen worden getransfecteerd, probeer dan: <ul><li> afnemende opnameafstand </li><li> toenemende druk op gas tank </li><li> het verhogen van de hoeveelheid goud </li><li> verhoging van het aantal van weefsel plakjes / goed </li><li> Zorg ervoor dat de O-ring in het vat-liner intact is. </li></ul> Als u plakjes te krijgen met zowel te veel en te weinig cellen getransfecteerd in dezelfde schieten er zeker van: <ul><li> dat u houdt het pistool symmetrisch bovenstaande goed </li><li> dat goud is gelijkmatig coaten van de binnenzijde van de slang. (Als u het krijgen van een lijn van goud, trekken uit het supernatans van de slang in een sneller tempo als het goud is geregeld en de gouden langer voordat het inschakelen van de stikstof te draaien. Als, aan de andere kant, je krijgt strepen van goud Dit is waarschijnlijk het gevolg van te veel vocht blootstelling tijdens bullet maken: zorg ervoor dat u een ongeopende fles EtOH gebruikt, dat de slang goed droog is voordat coating, en dat u aftopping deksels en het voorbereiden van kogels in een tijdig). </li></ul> Als transfectie-efficiëntie lijkt een optimale (# cellen getransfecteerd / slice), maar de uitdrukking niveau lijkt te hoog of te laag: <ul><li> aanpassen van de verhouding tussen DNA naar goud. (Bijv. als het te laag is behoud van de hoeveelheid goud, maar verhoging van het bedrag van het DNA.) </li><li> aanpassen van de hoeveelheid tijd tussen opname en het verzamelen van gegevens </li></ul> In het geval van duale transfectie, als je krijgt te weinig uitdrukking van een van uw construeert, pas de verhouding van de twee constructies in de passende wijze en zorg ervoor dat beide constructen zijn onder dezelfde promotor, om zeker te maken dat een promotor zal niet uit-concurrentiebedingen de andere.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Biolistische transfectie is een fysische weg van transfecteren cellen via bombardement van levend weefsel met een hoge snelheid van DNA-gecoate gouddeeltjes. In deeltje gemedieerde gen-overdracht, resulteren in het algemeen getransfecteerde cellen wanneer de kogel tot rust komt in de kern. Hoewel veel verschillende transfectie methoden bestaan, zoals micro-injectie, lipofectie, calcium-fosfaat transfectie, elektroporatie en virale transfectie, kan biolistische transfectie bieden een minder arbeidsintensief, en efficiënt alternatief voor transfecteren cellen die niet gemakkelijk worden getransfecteerd met behulp van deze andere methoden. In feite, werd eerst ontwikkeld als een techniek voor gentransfer in planten omdat de aanwezigheid van de celwand gemaakt transfectie moeilijk met behulp van reeds bestaande methoden 1. Ook heeft biolistics aan populariteit gewonnen op het gebied van de neurobiologie, omdat post-mitotische neuronen zijn notoir moeilijk te 2,3 transfecteren. In het bijzonder wordt algemeen erkend als het principe techniek die wordt gebruikt in experimenten die gericht zijn op het beoordelen van fijne morfologie van enkele neuronen in de hersenen intact plakjes. De beschreven methoden hier een gedetailleerde en uitvoerige uitleg over hoe biolistische transfectie van gekweekte hersenen plakjes uit te voeren met behulp van een hand gehouden gen-gun (de Helios Gene Gun systeem, Bio-Rad). Biolistische transfectie is uitgegroeid tot de aangewezen methode voor transfecteren neuronen in slice cultuur omdat het toelaat transfectie van een dunne aantal cellen in de hersenen slice. Op deze manier kunnen individuele neuronen worden onderzocht in isolement. Omdat deze techniek is vooral geschikt voor transfecteren neuronen in de hersenen slice, wordt het vaak gebruikt in combinatie met twee-foton microscopie, sinds 2-foton excitatie maakt visualisatie van fluorescent gelabelde cellen diep in lichtverstrooiing weefsel 4. Inderdaad de hoge vergroting beelden van een piramidale neuronen gepresenteerd in deze video werden vastgelegd met behulp van een custom-built twee-foton laser scanning microscoop. Tot slot biolistische transfectie is een efficiënt middel van transfectie individuele cellen binnen de context van een hoge dichtheid van de omringende cellen, en als zodanig heeft bewezen zeer nuttig zijn voor fluorescent etikettering van individuele neuronen in neuronale slice cultuur.

Hoewel we hebben een lijst van alle producten afzonderlijk, is het voordeliger kopen &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, waaronder met alle producten van Bio-Rad hierboven genoemde (cat # 165-2.431).

de voorbereiding van gene gun bullets and biolistische transfectie van neuronen in slice cultuur

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistische transfectie is een fysiek middel om transfecteren cellen door het bombarderen van weefsel met een hoge snelheid van DNA-gecoate deeltjes. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor biolistische transfectie van rat hippocampale slices, vanaf de eerste voorbereiding van DNA-gecoate kogels aan de laatste opnames van de organotypische slice culturen met behulp van een gen pistool. Gene pistool transfectie is een efficiënte en gemakkelijke manier van transfecteren neuronen en is vooral nuttig voor fluorescent labelen van een kleine subset van cellen in weefsel slice. In deze video, moeten we eerst een overzicht van de stappen die nodig zijn voor het coaten van gouddeeltjes met DNA. We vervolgens zien hoe aan de binnenkant van de plastic buis lijn met de goud / DNA-kogels, en hoe deze buis gesneden om de plastic cartridges te verkrijgen voor het laden in het gen pistool. Tot slot voeren we biolistische transfectie van rat hippocampus slice culturen, waaruit blijkt het hanteren van de Bio-Rad Helios-gen geweer, en het aanbieden van trouble shooting advies aan een gezonde en optimaal getransfecteerd weefsel plakjes te verkrijgen.

We beschrijven een methode voor het bereiden van DNA-gecoate goud kogels en demonstreren het gebruik van dergelijke kogels om biolistically transfecteren neuronen in de hippocampus gekweekte plakjes.

De voorbereiding van Gene Gun Bullets and biolistische Transfectie van Neuronen in Slice Cultuur

Biolistische transfectie is een fysieke methode om cellen te transfecteren door weefsel te bombarderen met DNA-gecoate deeltjes met een hoge snelheid. Wij bieden een gedetailleerde ...

Transfectie met een biolistisch apparaat of gene gun is een fysieke methode om cellen te transfecteren door weefsel te bombarderen met DNA-gecoate deeltjes met hoge snelheid. Deze techniek is een efficiënte en eenvoudige manier om neuronen te transfecteren en is bijzonder nuttig voor het transfecteren van slechts een klein aantal cellen in een weefselcoupe. Dit is bijvoorbeeld het geval bij fluorescentiemicroscopie-studies die gericht zijn op het onderzoeken van de neuronale morfologie in een intacte coupe.Bic-transfectie vergemakkelijkt de visualisatie van individuele neuronen tegen een schone achtergrond van niet-getransfecteerde cellen. In deze video demonstreren we een methode voor het maken van DNA-gecoate gene gun-pellets en het vervolgens uitvoeren van Bic-transfectie in organotypische hippocampusschijfculturen. Hallo, ik ben Georgia Woods.Ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Karen Zito aan de University of California in Davis. Vandaag zal ik demonstreren hoe u DNA-gecoate pellets maakt en hoe u Bic-transfectie uitvoert op hippocampaal weefsel van ratten. De basisstappen die ten grondslag liggen aan Bic-transfectie zijn: ten eerste gouden nanodeeltjes coaten met het te transfecteren DNA, en ten tweede de binnenkant van de plastic buisjes coaten met dit goud.Snijd de slang in cartridges om in het genenkanon te laden en schiet vervolgens op het weefsel dat getransfecteerd moet worden. Laten we beginnen. Voordat we klaar zijn om te transfecteren, moeten we eerst de DNA-gecoate korrels voorbereiden.Dit houdt in dat gouddeeltjes van 1,6 micron worden gecoat met het DNA-plasmide dat getransfecteerd moet worden. Tijdens het schieten fungeert een individueel gouddeeltje als de kogel die de cel binnendringt, wat leidt tot transfectie. Daarom moeten we eerst het te transfecteren DNA voorbereiden.Idealiter gebruikt u minder dan 50 µg DNA per set bullets in een totaalvolume van 50 µL water. Houd er rekening mee dat de exacte hoeveelheid DNA die moet worden gebruikt, voor elk construct empirisch moet worden bepaald op basis van het verkrijgen van het optimale expressieniveau. Nu we onze DNA-aliquot hebben, moeten we spermidine toevoegen aan de goudbolletjes.Voeg aan de acht mg vooraf afgewogen goud honderd µL sperma toe en sonicize gedurende ongeveer 20 seconden. Het is sperma.Meine is een polyamine dat de gouden leids positivo oplaadt, waardoor negatief geladen DNA interacteert met het positief geladen metaal. Voeg na de 22e zoon de 50 µL DNA-wateroplossing toe aan het goud. Zodra het DNA aan de kralen is toegevoegd, wordt er gevortexd terwijl honderd µL calciumchloride druppelsgewijs wordt toegevoegd; calciumchloride zorgt ervoor dat het DNA neerslaat.Laat de oplossing na een korte vortexbehandeling 10 minuten bezinken. Na deze bezinkingsperiode van 10 minuten worden het DNA en het goud gedurende 30 seconden op maximale snelheid gecentrifugeerd in een tafelcentrifuge. Pipetteer na deze 32e hoge-snelheidscentrifugatie het grootste deel van het supernatant weg, maar vermijd het opzuigen van het goudprecipitaat. Op dit moment verwijder ik simpelweg al het DNA dat niet op het goud is neergeslagen.De gouddeeltjes worden vervolgens gewassen in één milliliter verse ethanol en kortstondig gesoneereerd. Zodra het DNA neerslaat, heeft het de neiging om het goud te laten klonteren. Een lichte sonicatie breekt deze goudklonters af. Wees echter voorzichtig om het DNA niet af te scheren door overmatige sonicatie.De goudpellets worden opnieuw gecentrifugeerd en de ethanol wordt verwijderd door middel van pipetteren. Herhaal de ethanolwas nog twee keer. Voeg na de derde ethanolwas 200 µL van de verdunde polyvinylpyrrolidon- of PVP-oplossing toe en soniceren.Draag het gecoate goud kort over naar een conische buis van 15 mil die al 200 µL verdunde PVP-oplossing bevat. PVP is een oplosmiddel dat ervoor zorgt dat de gouddeeltjes aan de gebruikte plastic buisjes hechten. Verwijder in de volgende stap sporen van overgebleven goudbolletjes in de epit-buis door 200 µL PVP aan de epit-buis toe te voegen.Vervolgens kort centrifugeren en overbrengen naar de 15 ml conische buis. Herhaal dit totdat al het goud is overgebracht naar de 15 ml conische buis. Breng de resterende PVP-oplossing over, zodat het goud nu is geresuspendeerd in 3,2 ml PVP-ethanoloplossing.Nu zijn we klaar om de plastic buis te coaten die gebruikt zal worden om de gene gun-projectielen te huisvesten wanneer deze in de gene gun worden geladen. Nu het goud met DNA is gecoat, moeten we de binnenkant van de plastic buis bekleden met de gouddeeltjes. Deze goudgecoate plastic buis is wat daadwerkelijk in de gene gun-buis zal worden geladen.Begin met het afsnijden van een stuk slang zodanig dat dit ongeveer twee inch voorbij de O-ring uitsteekt. Zodra de slang in het voorbereidingsstation voor slangen is geplaatst, draait u aan de drukventiel zodat de flowmeter ongeveer 0,4 aangeeft. Stikstof zorgt voor een watervrije atmosfeer om de slang te drogen; droog de slang gedurende ongeveer 20 minuten.Het is het beste om deze droogstap uit te voeren terwijl u de gouden kogels met DNA coatet, zoals beschreven in de vorige stap. Op die manier is de buising droog en klaar om te coaten zodra u klaar bent. Bereid de gouden kralen voor nu de buising droog is en het goud met DNA is gecoat.Schakel het N2-station uit voordat u de slang vult met uw goud-PVP-oplossing. Verwijder de droge slang uit het station en bevestig deze aan een spuit van 10 ml voordat u de PVP en het goud in de slang opzuigt. Schud de oplossing grondig en zuig deze onmiddellijk op in de droge slang, waarbij u luchtbellen vermijdt. Let er daarnaast op dat u de oplossing niet in de spuit zelf opzuigt.Nadat de slang is gevuld met de PVP Gold-oplossing, plaatst u de slang voorzichtig terug in het N two-station. Laat de oplossing vijf minuten rusten met de spuit bevestigd, zodat de gouddeeltjes naar de bodem van de slang zakken. Markeer de uiteinden van de slang waar de oplossing bezinkt.Nadat de oplossing is bezonken, zal er met de bijgevoegde spuit een gouden streep zichtbaar zijn op de bodem van de buis. Trek het supernatant zeer langzaam weg, waarbij u ervoor zorgt dat u de buis niet terugspoelt of loskoppelt. Nu moeten we de buis draaien en drogen om het goud gelijkmatig aan de binnenzijde van de buis te laten hechten.Draai de slang eerst 90 graden. Laat dit twee seconden rusten. Draai nu nog eens 180 graden en laat dit opnieuw twee seconden rusten.Draai vijf seconden en zet vervolgens de N2 aan zodat de meter tussen 0,4 en 0,5 aangeeft, en centrifugeer terwijl de tubing vijf minuten lang droogt. Nu de vijf minuten voorbij zijn en ons goud droog is, moeten we de tubing in cartridges snijden die in het genenpistool geladen kunnen worden. Ik snijd de tubing nu in stukken van ongeveer een halve inch om de hulsjes te maken die een passende maat hebben om in de cilinder van het genenpistool te laden.Om de hulzen te verzamelen, plaatst u de simulatiegal voor zeehonden onder de snijder, snijdt u de slang bij de markeringen door en snijdt u de slang door met een schoon scheermes. Plaats de slang in de slanghakker om een passende lengte af te snijden. Voer de slang simpelweg naar voren tot u weerstand voelt en snijd deze vervolgens door.Zodra de buisjes zijn doorgeknipt en in het scintillatiebuisje zijn verzameld, plaatst u een droogmiddelpellet in het scintillatiebuisje. De pellets blijven tot zes maanden goed, maar na twee tot drie maanden kan een afname in transfectie-efficiëntie optreden. Daarom is het raadzaam om het buisje te labelen met de naam van het construct en de datum.De bullets kunnen direct na bereiding worden gebruikt of bewaard worden bij vier graden Celsius. Indien u gebruikmaakt van bullets die bij vier graden Celsius zijn bewaard, laat het sation-flacon dan ongeveer 15 minuten op kamertemperatuur opwarmen voordat u het opent, om te voorkomen dat de bullets vocht absorberen. We zijn nu klaar om de DNA-bullets af te vuren met een gene gun.Nu de pellets zijn gemaakt, ben ik klaar om de cellen daadwerkelijk te transfecteren. Ik zal een BioRad Helios gene gun gebruiken en rat hippocampal slices beschieten die vijf dagen zijn geïncubeerd sinds de dissectie. De gene gun zal worden aangesloten op een heliumgastank.Wanneer het pistool wordt afgevuurd, zal een korte drukstoot vanuit de tank de gouddeeltjes bij de plak versnellen. In algemene zin: wanneer een gouddeeltje in de celkern terechtkomt, wordt die cel getransfecteerd.Aangezien ik gekweekte plakjes transfecteer, hanteer ik gedurende de gehele Bic-transfectie een relatief steriele techniek om contaminatie te voorkomen. Zodra de cartridges op kamertemperatuur zijn, opent u het simulatievlaasje en plaatst u de goudgecoate plastic cartridges in de cartridgehouder. Plaats vervolgens de cartridgehouder in de gene gun door eerst de cilindersluiting naar achteren te duwen.Nu moet de loopvoering aan het pistool worden bevestigd. Controleer eerst of de O-ring in de loopvoering zit en of het diffusiescherm goed vastzit. Het scherm zorgt ervoor dat de druk vanuit de loop wordt verspreid, wat leidt tot het spuiten van het goud voor een gelijkmatigere verspreiding van het goud in de well.Schroef de loopvoering volledig in het genenpistool. Bij het schieten van twee verschillende constructen kunnen beide sets projectielen in dezelfde patroonhouder worden geladen, maar de loopvoering en het scherm moeten tussen de constructen worden gewisseld. Het genenpistool is nu klaar om aan de heliumbron te worden bevestigd.Sluit het genenkanon aan op de slang die verbonden is met de heliumgastank. Het kanon moet in elkaar klikken; stel vervolgens de druk op de tank in op 180 PSI. Het kanon is nu klaar voor gebruik, maar denk eerst aan het dragen van gehoorbescherming en schiet een lege lading af om eventueel stof of vuil van het diffusiescherm te verwijderen.Druk eerst op de veiligheidsknop tot het pistool piept en knijp in de trekker. Nu zijn we klaar om de slice te bestralen. Haal na het bestralen van de blanco de slices uit de incubator.Tijdens onze dissecties van de hippocampus plaatsen we vier coupes per putje en rangschikken we deze zodanig dat ze de hoekpunten vormen van een vierkant van twee centimeter nabij het centrum van het membraan. Fotografeer elk putje met het diffusiescherm op ongeveer een halve tot één inch afstand van de coupe. Getransfecteerde cellen kunnen gewoonlijk binnen één tot vijf dagen worden onderzocht, afhankelijk van het construct.Zodra alle wells zijn beschoten, dient het gas te worden uitgeschakeld en de druk te worden afgelaten voordat het geweer van de heliumslang wordt losgekoppeld. Verwijder de cartridges en de gebruikte hulzen. Schroef de loopvoering los; de cartridges, loopvoeringen en filters kunnen worden gereinigd door ze in een sopje te plaatsen en 20 minuten te ultrasoniceren, vervolgens grondig met water af te spoelen, een uur te laten weken in 70% ethanol en ze daarna overnacht op een droog papieren handdoek te leggen.Schone cartridges en filters kunnen vervolgens worden hergebruikt bij een volgende biotische transfectie. Laten we nu kijken naar enkele van de transfectieresultaten. Zelfs voor een standaard hippocampusslice-preparaat kan er een vrij grote variatie zijn in transfectie-efficiënties, afhankelijk van de bullets en de slices.Over het algemeen is een relatief lage transfectie-efficiëntie wenselijk om mooi geïsoleerde getransfecteerde neuronen te verkrijgen. Bovendien wordt, wanneer te veel cellen worden getransfecteerd, de algehele gezondheid van de slice aangetast, zelfs onder optimale condities. Gewoonlijk zijn er minder dan 20 cellen per slice, maar vaak zullen andere slices in dezelfde well veel meer cellen bevatten.Getransfecteerde en andere coupes zullen minder cellen bevatten. Inconsistenties in de transfectie-efficiëntie tussen de coupes zijn meestal te wijten aan het feit dat ofwel de plaatsing van de coupes ten opzichte van het vat niet symmetrisch was, of dat het goud niet gelijkmatig rond de buisjes was gecoat, maar geconcentreerd was aan één zijde. Als er te veel cellen worden getransfecteerd, probeer dan de schietafstand tot het monster te vergroten, de schietdruk te verlagen of de hoeveelheid goud voor het maken van de pellets te verminderen.Hier ziet u een uitstekend voorbeeld van een getransfecteerde ca1 parametale neuron. In deze specifieke cel kunnen we een goudbullet zien die in de cel is ingebed. Hier is een dichtere blik op een getransfecteerde neuron. In ca1 kan stimulatie soms leiden tot ongezonde coupes.Vaak resulteren de drukstoten in ongezonde coupes. Het Helios gene gun-systeem wordt geleverd met een diffusor met een metalen kruis in het midden. We hebben het binnenste metalen kruis verwijderd en in plaats daarvan een metalen scherm op de plek van dit kruis gebruikt.We snijden het scherm simpelweg iets groter uit dan het uiteinde van de barrel liner en klemmen het tussen het uiteinde van de barrel liner en de gesneden diffuser. We hebben vastgesteld dat dit de vitaliteit van de coupes verbetert. Bovendien zullen de optimale schietcondities variëren per experimentele preparatie; om deze voor verschillende preparaties te optimaliseren, kan de druk op de heliumtank en de schietafstand vanaf het monster worden gevarieerd.Ten slotte, indien u bullets wilt laden met twee verschillende constructen voor duale transfectie, zorg er dan voor dat beide constructen onder dezelfde promotor staan. Op die manier zal de ene promotor de andere niet overvleugelen. Ik heb u zojuist laten zien hoe u gene gun bullets voorbereidt en hoe u hippocampale coupes transfecteert met behulp van BIC-transfectie.Dit is een uiterst krachtige methode voor het uitvoeren van morfologische studies op individuele neuronen die geïsoleerd kunnen worden afgebeeld. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gene-gun Transfectie van de hippocampus Neuronen

Dit artikel toont de dissectie en incubatie van konijnen netvlies en deeltjes-gemedieerde gen-overdracht van plasmiden die coderen voor GFP of een verscheidenheid van subcellulaire markers in de retinale ganglioncellen.

Organotypische Cultuur van Adult Rabbit Retina

Directe intranucleaire injectie van cDNA is een effectieve techniek voor transfectie post-mitotische cellen. Deze methode biedt een hoge mate van heterologe eiwitexpressie van een of meerdere cDNA constructen en maakt het mogelijk eiwit functie die moet worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving met een verscheidenheid van enkele cel assays.

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Dit is een protocol voor te bereiden en een neocorticale slice voorbereiding handhaven organotypische cultuur voor het maken van elektrische opnames van piramidale neuronen.

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Source: Keener, D. G., et al. Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the process of single-cell electroporation to introduce plasmid DNA into neurons within mouse hippocampal slice cultures. The procedure involves precise pipette positioning, pressure adjustments, and electroporation pulses to transiently permeabilize the neuronal membrane,...

Gene Expression via Single-Cell Electroporation in Mouse Hippocampal Slice Cultures

This video demonstrates the protocol for single-cell electroporation of genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice cultures. The technique is useful to examine specific molecular and physiological functions of neurons, including cell autonomous mechanisms and transsynaptic protein interactions.

Single Cell Electroporation in Organotypic Brain Slice Cultures: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids Inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Recente verbeteringen in organotypische herfsnijspreparaten hebben hun exploitatie voor biotechnologische toepassingen mogelijk gemaakt. Organotypische plakjes behouden lokale structurele kenmerken van in vivo biologie, inclusief functionele synaptische verbindingen. Hier presenteren we een regioselectieve biolistische afleveringsmethode om deze plakjes te labelen en genetisch te manipuleren.

Regioselectieve Biolistische Targeting in Organotypische Brain Plakjes met een aangepaste Gene Gun

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Leer biolistische transfectie van neuronen in hippocampale slicecultures met DNA-gecoate gouden kogels. Deze methode maakt efficiënte transfectie van specifieke neuronen mogelijk met een schone achtergrond voor visualisatie.

De voorbereiding van Gene Gun Bullets and biolistische Transfectie van Neuronen in Slice Cultuur

Meer video's verkennen