LED-gebaseerde in-vitroscreening voor het beoordelen van fotoactiveerbare moleculen bij bacteriële fotodynamische inactivatie

Mijn onderzoek is gericht op het verkennen van verschillende moleculen uit de familie van flavyliumverbindingen, zowel natuurlijke als synthetische, met een kerninteresse in het bestuderen van hun bioactiviteit in de context van UV-fotoprotectie en het evalueren van hun potentieel als fotosensibilisatoren voor fotodynamische therapietoepassingen. De recente bevindingen in onze onderzoeksgroep toonden de door licht geactiveerde eigenschappen van op aminozuren gebaseerde flavyliumkleurstoffen aan, waardoor ze een veelbelovende nieuwe klasse van fotosensibilisatoren werden. Deze verbindingen vertonen een aanzienlijk potentieel voor verdere exploratie en maken de weg vrij voor innovatieve toepassingen in het veld.

Met behulp van het 96-well microtiter- en lichtpaneelsysteem kunnen we een high-throughput screening van fotosensibilisatoren in een gecontroleerde omgeving verkrijgen, waardoor de identificatie en vergelijking tussen verschillende kandidaten voor fotodynamische therapie wordt vereenvoudigd. Introduceer om te beginnen de Staphylococcus aureus-bacterie op de Mueller-Hinton-agarplaat uit de stopcultuur. Incubeer de plaat 24 uur op 37 graden Celsius om verse cultuur te verkrijgen.

Verzamel twee tot drie verse kolonies van de agarplaat en verdun ze in zes milliliter voorverwarmd steriel gefilterd PBS bij pH 7,4. Draai het inoculum met 1.200 omwentelingen per minuut gedurende drie tot vier cycli om het monster te homogeniseren en trek drie milliliter van het gehomogeniseerde inoculum op in een wegwerpcuvet. Na het meten van de optische dichtheid bij 600 nanometer, verdunt u het monster om overeen te komen met de optische dichtheid van 0,1 met behulp van PBS.

Bereid een stockoplossing van de fotosensibiliserende verbinding in een geschikt oplosmiddel zoals DMSO of PBS. Verdun de voorraadoplossing in PBS om de werkende oplossing te creëren en zorg ervoor dat de componenten van de bacteriekweekmedia de lichtabsorptie niet verstoren. Vortex de werkoplossing om volledige homogenisatie te garanderen.

Bereid om te beginnen de Staphylococcus aureus-suspensie en de werkoplossing van de fotosensibilisatorverbinding. Bereid twee afzonderlijke platen met 96 putjes voor, een voor blootstelling aan licht en een andere voor donkerregeling. Doseer in elke plaat 100 microliter van de fotosensibiliserende oplossing en de bacteriële suspensie.

Meng de oplossingen 5 tot 10 keer met de pipet. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de fotosensibilisator te laten interageren met de bacteriële cellen. Na de incubatie de platen uit de broedmachine halen.

Houd een van de platen beschermd tegen blootstelling aan licht als de donkerregeling. Plaats de andere 96-well plaat boven het rechthoekige 50 watt LED paneel. Markeer de randen van de plaat op het LED-oppervlak om een consistente plaatsing over protocolherhalingen te garanderen.

Stel de plaat ongeveer 15 minuten bloot aan LED-licht. Gebruik een andere plaat met 96 putjes om seriële verdunningen van de monsters te bereiden, inclusief controles, niet-bestraalde en bestraalde putjes. Voeg 180 microliter PBS toe aan elk putje, afhankelijk van het aantal monsters.

Verdeel 20 microliter uit elk putje in de bestraalde en niet-bestraalde platen in de eerste kolom van de met PBS gevulde plaat. Voer met behulp van een meerkanaals micropipet een eenvoudige seriële verdunning uit van putje 1 tot 6. Verdeel een agarplaat in zes gelijke delen, waarbij elke sectie overeenkomt met een van de verdunningen.

Verdeel 10 microliter uit elk putje op het overeenkomstige gedeelte van de agarplaat. Incubeer de plaat gedurende 18 tot 20 uur. Verwijder de agarplaat uit de broedmachine en identificeer gebieden die geschikt zijn voor het tellen van kolonies.

Tel binnen elk deel van de vijzelplaat het aantal kolonievormende eenheden. Het spectrum van het zichtbare licht vertoonde drie verschillende pieken tussen 400 en 700 nanometer. Onder donkere omstandigheden vertoonde geen van de geteste flavyliumverbindingen cytotoxische effecten.

Daarentegen veroorzaakten de geteste verbindingen na blootstelling aan licht een dosisafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van Staphylococcus aureus, met significante effecten waargenomen bij concentraties van 6 en 12 micromolaren.