Detectie van anti-MDA5 auto-antilichamen met behulp van HeLa-cellen en immunocytochemie met lichtmicroscopie

Het belangrijkste doel van het volgende experiment is om immunocytochemie te gebruiken om te screenen op anti-MDA5-antilichamen. Dit wordt gedaan door de HeLa-cellen te gebruiken en vervolgens de HeLa-cel te transfecteren met MDA5-constructie. Als zodanig zullen de HeLa-cellen MDA5-eiwitten produceren die kunnen worden gehecht door MDA5-antilichamen.

Na opname van de HeLa-cel met MDA5-construct, wordt het Triton-reagens gebruikt om het membraan van HeLa-cellen te permeabiliseren, waardoor de anti-MDA5-antilichamen kunnen passeren. Waarna het patiëntenserum wordt toegevoegd dat de anti-MDA5-antilichamen bevat. De anti-MDA5-antilichamen zouden zich dan hechten aan de MDA5-eiwitten in de HeLa-cellen.

Daarna worden secundaire antilichamen, waaraan mierikswortelperoxidase is gehecht, in de cellen ingezet, de secundaire antilichamen zouden zich dan hechten aan de anti-MDA5-antilichamen. Ten slotte wordt het chromogeen aan de cellen toegevoegd en geoxideerd in aanwezigheid van mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen, waardoor een zichtbare kleur wordt geproduceerd onder een optische microscoop. Een positief staand resultaat zou zoiets laten zien als de foto hierboven.

In de videodemonstratie van vandaag gaan we over in een cruciaal gebied van medisch onderzoek, de detectie van anti-melanoomdifferentiatie-geassocieerd gen vijf-antilichaam, ook wel anti-MDA5-antilichaam genoemd. Deze auto-antilichamen spelen een cruciale rol als eenvoudige diagnostische indicator voor patiënten met interstitiële longziekte, vooral die met snel progressieve De betekenis van dit onderzoek ligt in de mogelijke impact ervan op de patiëntresultaten. Vroege en nauwkeurige detectie van MDA5 auto-antilichaam is van vitaal belang voor een effectieve behandeling van deze ernstige auto-immuunziekte.

Het belangrijkste voordeel van de methode die we hebben gedemonstreerd ten opzichte van de gouden methode voor het screenen van anti-MDA5 auto-antilichamen is dat het sneller kan worden gedaan en tijd en moeite bespaart in vergelijking met de traditionele radioactief gelabelde immunovisitatietest. Deze verhoogde efficiëntie stelt ons in staat om meer monsters te verwerken en snel resultaten te genereren. Bovendien is het van cruciaal belang op te merken dat onze methode niet alleen superieure efficiëntie biedt, maar ook zichzelf in veiligheid en kosteneffectiviteit in vergelijking met de overgangsimmunoprecipitatietest.

Nu, laten we eens kijken hoe het wordt gedaan. Mijn onderzoeksassistent, Teo Kai Fa, zal de procedure leiden. Onderhoud HeLa-cellen met Dulbecco's Modified Eagle's Medium met 10% foetaal runderserum en 1% antibioticum antimycoticum bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.

Passeer de cellen elke twee tot drie dagen, of wanneer de cellen 90 tot 100% samenvloeiing bereiken. Plaats 70.000 HeLa-cellen op elke put van een plaat met 24 putjes. 24 uren vóór transfectie, en netto de cellen, die ongeveer 90%confluency zijn.

Verdun 500 nanogram plasmine en 1,5 microliter transfectiereagens elk in een 25 microliter gereduceerd serummedium. Voeg verdund DNA toe, doe verdund transfectiereagens in een één-op-één-verhouding Meng goed en incubeer gedurende vijf minuten.

Voeg het mengsel toe aan de cellen die een dag ervoor zijn geplaatst en schud om het DNA-lipidencomplex onmiddellijk te mengen. Controleer of de cellen voor 80 tot 90% samenvloeien. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius op een bevochtigd 5% CO2-halfrond, 40 tot vier uur, en ga verder met immunocytochemie.

We hanteren een in de handel verkrijgbare factor. Meer informatie is te vinden in de materiaaltabel. Hun transfectiedoeltreffendheid is 50%Success van transfectie en expressie van het doeleiwit kan worden bepaald door de cellen met bevroren eiwit te transfecteren dat plasmide tot expressie brengt en westers bloed leidt om uitdrukking van het doeleiwit te visualiseren Na incubatie, was de cellen tweemaal met PBS om alle resterende media te verwijderen.

Het wassen kan worden uitgevoerd door de plaat of een orbitale schudder te schudden. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde in PBS Let op. Paraformaldehyde is giftig.

Gebruik de juiste richtlijnen voor het hanteren. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur staan. Gooi vervolgens het fixatief reagens weg.

Gebruik PBS om de cel twee keer te wassen. Breng Triton-reagens aan en laat de cellen vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur staan. We gebruikten Triton X 400 in PBS in een concentratie van 0,3% Gooi na 10 minuten het Triton-reagens weg.

Voeg PBS toe om de cellen één keer te wassen. Volgende stap, voer blokkering uit met 10% foetaal runderserum in PBS en laat de cellen een uur op kamertemperatuur staan, verwijder het blokkerende reagens. Voeg vervolgens PBS toe om de cellen één keer te wassen.

Voeg het verdunde patiëntplasma toe aan de cellen. Zorg ervoor dat u het plasma van de patiënt vóór gebruik verdunt in een verhouding van één tot 5.000 verdunning in PBS. Pas de verdunning aan om het signaal te versterken of verminder de achtergrond indien nodig om onbevooroordeelde resultaten te garanderen.

Het personeel voerde de test uit, wist niet welke monsters van patiënten waren en welke van gezonde personen waren. Incubeer een monster bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Verwijder na de incubatietijd het monster van de patiënt en was de cellen drie keer met PBS.

Behandel de cellen met verdunde mierikswortelperoxidase-geconjugeerde geit, anti-humaan IgG in een verhouding van één tot 250 verdunning in PBS. Laat de cellen een uur op kamertemperatuur staan. Gooi een uur later het secundaire antilichaam weg.

Spoel driemaal met PBS. Kleur de cellen na het wassen van de cellen met 300 microliter DAB-werkoplossing per putje. De DAB-werkoplossing wordt bereid door ontbrekend DAB-promotieconcentraat en DAB-verdunningsmiddel volgens de instructies van de fabrikant.

Nadat u de cel vijf minuten hebt gekleurd, verwijdert u de kleurstof. Spoel na het verwijderen van de kleurstof af met het geïoniseerde gedestilleerde water en schud gedurende vijf minuten. Tegenkleur de celkern met verdund hematoxine.

We gebruiken hemotoxine in om als een, in 10 verdunningsvouw. Wacht vijf minuten op het kleuringsproces. Gooi na vijf minuten het hemotoxine weg en was vervolgens twee keer gedurende vijf minuten met het geanalyseerde gedestilleerde water.

Bekijk in de laatste stap de kleuringsresultaten onder een optische microscoop. Laten we onze immunocytochemische testresultaten voor anti-MDA5 auto-antilichamen interpreteren. Een positief resultaat.

Een echt positief resultaat vertoont sterke bruine kleuring in HeLa die MDA5 tot expressie brengt. Dit bevestigt anti-MDA5 auto-antilichamen in het monster van de patiënt. Een negatief resultaat.

Een negatief resultaat toont HeLa-cellen zonder bruine kleuring, wat wijst op geen anti-MDA5 auto-antilichamen. Een vals positief resultaat. Cruciaal is dat een vals-positief uitgebreide bruine kleuring vertoont in alle cellen, ongeacht de expressie van MDA5s.

Deze niet-specifieke kleuring die wordt gezien in volgorde van auto-immuunziekten, moet worden onderscheiden van een echt positief om een verkeerde diagnose te voorkomen. Onze methode biedt een snellere, veiligere en kosteneffectievere manier om anti-MDA5-orgaanantilichamen te detecteren. Dit kan een aanzienlijke invloed hebben op de patiëntresultaten bij de behandeling van interstitiële longziekte.

Na het bekijken van deze video hebt u geleerd hoe u de immunocytochemische procedure moet uitvoeren en hoe u klinisch relevant kunt identificeren in de testresultaten.