Name: Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer fluorescentielabeling voor laag-expressie-eiwitten in zebravislarven met geoptimaliseerde donorconstructie. Deze methode vereenvoudigt eiwitvisualisatie en versnelt onderzoek naar eiwitlokalisatie in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Fluorescerende eiwitlabeling in zebravislarven met behulp van CRISPR/Cas9 knock-in

<ol><li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+imaging+reveals+hidden+oncogenic-normal+cell+communication+during+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis.</a> Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).</li>
<li>Gomes, M. C., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+modeling+human+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The case for modeling human infection in zebrafish.</a> Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Sci Rep. 6, 29490(2016).</li>
<li>He, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ligase+3-dependent+microhomology-mediated+end+joining+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos.</a> Mutat Res. 780, 86-96 (2015).</li>
<li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR%2FCas9+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Sci Rep. 5, 8841(2015).</li>
<li>Luo, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+of+zebrafish+using+a+seamless+integration+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.</a> FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> Elife. 9, e53968(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tagging+strategies+for+illuminating+expression+profiles+of+genes+with+different+abundance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish.</a> Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+based+protocol+for+detecting+indel+mutations+induced+by+TALENs+and+CRISPR%2FCas9+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (6), e98282(2014).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+39.9+protein+is+necessary+for+coordinated+activation+of+slow-twitch+muscle+and+normal+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish.</a> J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).</li>
<li>Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+expression+analysis%2C+and+functional+characterization+of+connexin44.1%3A+a+zebrafish+lens+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein.</a> Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).</li>
<li>Urushibata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+speed+in+zebrafish+embryos+using+different+incubation+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures.</a> Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+digestion+and+ligation-mediated+PCR+used+for+flanking+sequence+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking.</a> Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &micro;L&nbsp; tips</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor alle manipulaties</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor opslag en centrifugatie van verschillende oplossingen</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes (RNase-free)</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor opslag en centrifugatie van RNase-vrije oplossingen</td></tr><tr><td>10 &micro;L tips</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor alle manipulaties</td></tr><tr><td>10 &micro;L tips (RNase-free)</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor RNase-vrije manipulaties</td></tr><tr><td>1000 &micro;L&nbsp; tips (RNase-free)</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor RNase-vrije manipulaties</td></tr><tr><td>1-fenyl 2-thioureum (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Om melanogenese te remmen en de larven transparant te houden</td></tr><tr><td>200 &micro;L tips</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor alle manipulaties</td></tr><tr><td>200 &micro;L tips (RNase-free)</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor RNase-vrije manipulaties</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>PCR voor sgRNA efficiëntietests</td></tr><tr><td>35-mm schalen</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor het tijdelijk en individueel kweken van zebravissen</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>Voor enzymatische vertering</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td>Voor TAE-bufferbereiding</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>Voor LB-platen</td></tr><tr><td>Ampicilline, natriumzout</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>Voor LB-platen</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Voor embryobufferbereiding</td></tr><tr><td>Capillaire buizen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>Voor het genereren van naalden voor injectie</td></tr><tr><td>Capillaire buizen</td><td>Elk merk</td><td>ID (binnendiameter) = 0,1 mm</td><td>Voor het kwantificeren van een 1-nL druppel</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&nbsp;http://www.crisprscan.org/</td><td>Voor sgRNA-ontwerp</td></tr><tr><td>DH5&alpha;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>Voor transformatie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Voor lysisbuffer en TAE-bufferbereiding</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>Ensembl</td><td>&nbsp;https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>Om geninformatie te vinden</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>Voor DNA-zuivering en extractie</td></tr><tr><td>Exonuclease III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td>LIC</td></tr><tr><td>Gas-aangedreven micro-injector</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Gelelektroforesesysteem</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor alle manipulaties</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>Voor LB-platen</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>Voor LB-platen</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>China Zebrafish Resource Center (CZRC)</td><td>CZP3</td><td>sgRNA-plasmide dat sgRNA-scaffold bevat</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Voor embryobufferbereiding</td></tr><tr><td>Lithiumchloride precipitatie oplossing</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>Precipitatie van sgRNA's, RNase-vrij</td></tr><tr><td>Lag smeltende agarose</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>Voor bereiding van 4% agarosegels</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>Voor LB-platen</td></tr><tr><td>Metaalbad</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor incubatie op constante temperatuur</td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Voor embryobufferbereiding</td></tr><tr><td>Microinjectievorm</td><td>Zelfgemaakt</td><td>N/A</td><td>Voor het genereren van groeven om embryo's vast te houden tijdens micro-injectie</td></tr><tr><td>Microloader, tip voor het vullen van Femtotips en andere glazen microcapillairen, steriel, 0,5 &ndash; 20 &micro;L, 100 mm, lichtgrijs, 192 stuks. (2 houders &times; 96 stuks.)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Om de micro-injectieoplossing in de injectienaald te laden, RNase-vrij</td></tr><tr><td>Micropipettrekker</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Voor het genereren van naalden voor injectie</td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Voor alle manipulaties</td></tr><tr><td>Microgolf</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor het gieten van injectieplaten en agarosegels</td></tr><tr><td>MinElute PCR-zuiveringskit (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>Om PCR-producten en digestieproducten te zuiveren, RNase-vrij</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcriptiekit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>In-vitro transcriptie van Cas9 mRNA, RNase-vrij</td></tr><tr><td>N2</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Voor embryobuffer en lysisbufferbereiding</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Voor embryobufferbereiding</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>Voor TAE-bufferbereiding</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>RNA-gerelateerde manipulaties, RNase-vrij</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td><td>Voor enzymatische vertering</td></tr><tr><td>PCR-machine</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>PCR stripbuizen</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor PCR</td></tr><tr><td>PCR-buizen</td><td>FEITONGKANG</td><td>blp-200</td><td>Voor PCR</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Elk merk</td><td>N/A</td><td>Voor het kweken van zebravislarven enz.</td></tr><tr><td>Fenolrood</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Voor micro-injectie, RNase-vrij</td></tr><tr><td>Pipet

fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

fluorescence-labeling-to-visualize-low-expressed-proteins-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Dit protocol schetst een manier om de label en sporen het lot van kleine groepjes cellen zebravis embryo's met behulp van UV-uncaging van gekooide fluoresceïne, gevolgd door een hele berg immunokleuring om het signaal van de Uncaged fluoresceïne versterken.

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.

Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.

Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Leer fluorescentielabeling voor laag-expressie-eiwitten in zebravislarven met geoptimaliseerde donorconstructie. Deze methode vereenvoudigt eiwitvisualisatie en versnelt onderzoek naar eiwitlokalisatie in vivo.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Meer video's verkennen