Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Dit product is geoptimaliseerd om eiwitten te nivelleren met de fluorescentie-eiwittag en om de locatie en de expressie van het eiwit van een interessant zebravislab te visualiseren. Het is vooral nuttig voor het afbeelden van eiwitten die in een lage overvloed tot expressie worden gebracht. Onze methode vereenvoudigt en versnelt het proces van donoropbouw.

Deze componenten, met uitzondering van de CDS, worden vooraf in de backbone opgenomen. De donor werd ook geoptimaliseerd om de efficiëntie te verhogen. De workflow voor het transmissiescherm accumuleert een overërbare kern tegen de laagste kosten van tijd en moeite.

Zebravis is het modelorganisme dat veel wordt gebruikt in onderzoek naar infectie en immuniteit. We zijn vooral geïnteresseerd in de mechanismen die ten grondslag liggen aan sepsis. Omdat we nu in staat zijn om fluorescentie-tagging gemakkelijk uit te voeren met behulp van ons protocol, zullen we proberen een afbeelding, sepsis-eiwitten en cellen in zebravissen te labelen.

Plaats om te beginnen een gezonde vrouwelijke zebravis en twee gezonde mannelijke zebravissen in een paringstank. Gebruik een scheidingswand om de mannetjes van de vrouwtjes te scheiden om ze voor te bereiden op de paring. Bereid op de dag van de micro-injectie de micro-injectiemix op ijs onder een RNase-vrije omgeving.

Laad met behulp van een Rnase-vrije pipetpunt de micro-injectieoplossing in de naald. Plaats de geladen naald in een micromanipulator die is bevestigd aan een micro-injector. Gebruik onder een microscoop een puntig pincet om de punt van de naald af te knippen door er voorzichtig in te knijpen totdat deze breekt.

Pas de injectiedruk aan totdat de naald consequent een druppel van één nanoliter uitwerpt. Verwijder vervolgens de verdeler uit de bevruchtingsbak en laat de vissen zes minuten broeden. Verzamel de embryo's in het eencellige stadium en breng ze over in een petrischaaltje met embryobuffer.

Onderzoek de gezondheid van de embryo's onder een lichtmicroscoop en verwijder onbevruchte eieren of puin. Zet 20 gezonde embryo's opzij in een apart petrischaaltje als niet-geïnjecteerde controles en label het schaaltje. Breng met een kleine borstel gezonde embryo's in het eencellige stadium over en leg ze voorzichtig op de groeven van een micro-injectieplaat die is opgewarmd tot kamertemperatuur.

Verwijder overtollige buffer van de plaat. Pas met behulp van een naaldpunt voorzichtig de positie van elk embryo aan zodat de dierenpool naar de naald wijst. Injecteer een nanoliter van de gemengde oplossing in de dierlijke pool.

Spoel de embryo's na de injectie voorzichtig af in een plaat met 6 putjes met embryobuffer. Plaats de plaat in een incubator met constante temperatuur van 28,5 graden Celsius. Onderzoek 10 uur na de bevruchting de embryonale ontwikkeling onder een stereomicroscoop en verwijder dode embryo's.

Verzamel 24 uur na de bevruchting embryo's in buisjes van 1,5 milliliter voor genotypering en gooi extra water voorzichtig weg. Voeg 100 microliter lysisbuffer met proteïnase K toe aan elke buis. Incubeer de buizen gedurende een uur bij 56 graden Celsius en vervolgens gedurende 15 minuten bij 95 graden Celsius.

Voeg na de incubatie 200 microliter ethanol toe en meng goed. Centrifugeer de buis gedurende 19.000 minuten bij 10 G en gooi het bovenstaande weg voordat u de pellet opnieuw suspendeert met 500 microliter 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw en droog de pellet aan de lucht voordat u deze oplost in 50 microliter dubbel gedestilleerd water.

Gebruik een microliter van het extract om het reactiemengsel voor de PCR te bereiden. Voer na PCR agarosegels uit met twee microliter PCR-producten om een succesvolle amplificatie te bevestigen. Voer enzymatische vertering uit om de efficiëntie van de sgRNA's te evalueren.

Meng de digestieoplossing voorzichtig en geïncubeerd bij kamertemperatuur, volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik agarosegels voor verteerde producten naast onverteerde PCR-controles om de spijsvertering te bevestigen. Om de efficiëntie van sgRNA te analyseren, opent u de TIDE-website en klikt u op Start TIDE.

Voer de gidssequentie van het sgRNA in het gidssequentieframe in. Klik op Bladeren om het sequentieresultaat van het wildtypebesturingselement te uploaden naar het chromatogramveld van het controlemonster. Upload op dezelfde manier het sequentieresultaat van het bewerkte monster naar het chromatogramveld van het testmonster.

Klik op Weergave bijwerken om de resultaten te analyseren. Gebruik om te beginnen ligatie-onafhankelijk klonen of LIC met exonuclease III om het donorplasmide te construeren. Ontwerp primer F1 met een overlappende volgorde met het vectorelement 1 en een deel van element 2.

Ontwerp primer R2 met een deel van element 1, element 2 en element 3. Ontwerp primer F2 om elementen 3 en 4 te bevatten, en de 5 priemsequentie van de CDS die de sgRNA-doelplaats volgt. Ontwerp primer R1 met de drie priemreeksen van de coatingsequentie en een overlappende sequentie met de vector.

Gebruik zebravis CDNA als sjabloon en voer PCR uit met de ontworpen primers. Zuiver de PCR-producten met behulp van ethanolprecipitatie. Verwerk de donorvector met restrictie-enzymen zoals pCI en Acc65I en zuiver de verteerde donorvector.

Kwantificeer de gezuiverde PCR-fragmenten en de verteerde donorvector met behulp van DNA-gelelektroforese. Bereid vervolgens de LIC-mix met gezuiverde donorvector en incubeer gedurende 60 minuten op ijs. Voeg een microliter 0,5 molaire EDTA toe om de reactie te stoppen.

Pipetteer op en neer om de oplossing te mengen. Incubeer het reactiemengsel gedurende vijf minuten bij 60 graden Celsius. Koel de LIC producten op ijs.

Transformeer vervolgens DH5-Alpha-competente cellen met behulp van LIC-producten. Leg de getransformeerde cellen op Luria-Bertani-platen die de ampicilline bevatten en laat ze gedurende 16 uur groeien. Pluk na de incubatie enkele kolonies uit de LIC-platen voor enzymatische spijsverteringsanalyse en DNA-sequencing.

Extraheer en zuiver de juiste donorplasmiden met een zuiveringskit. Injecteer zebravisembryo's met een micro-injectiemix voor genklopperij '12 tot 48 uur na micro-injectie, onder een stereofluorescentiemicroscoop, observeer de fluorescentie van de zebravislarven. Selecteer met behulp van een gevestigde screeningsmethode de fluorescerende larven en kweek ze afzonderlijk.

Verzamel op de leeftijd van een maand een klein stukje van de troetvin van elke verdoofde zebravis in een gelabeld PCR-buisje. Plaats de bijbehorende verdoofde zebravis in een bord met 6 putjes gevuld met UV-gesteriliseerd gefilterd water dat overeenkomt met het etiket op de buis. Extraheer genomisch DNA met behulp van de alkalische lysismethode.

Ontwerp een voorwaartse primer stroomopwaarts van de linker homologie-arm en een omgekeerde primer op de insert. Voer PCR uit, gericht op de vijf priemverbindingen van de sequentie. Onderzoek de F1-embryo's die zijn verkregen door de gescreende F-zebravis te paren met wildtype zebravissen op GFP-expressiepatronen.

Genotypeer de F1-embryo's met behulp van junctie-PCR. Overerfbare specifieke fluorescentie werd waargenomen in de spieren van alle F1-nakomelingen, wat wijst op de succesvolle GFP-labeling van connexon 39.9. Overerfbare specifieke fluorescentie werd gedetecteerd in de lens van alle F2-nakomelingen, wat wijst op succesvolle mCherry-tagging van connexon 44.1.

Het correct kloppen van de connexonen 39.9 en 44.1 werd geverifieerd door middel van junctiepolymerasekettingreacties.