Analyse van menselijke T-celactiviteit in een allogene co-cultuursetting van voorbehandelde tumorcellen

Tumorcellen veranderen het immuunfenotype tijdens de therapie, wat van invloed kan zijn op de uitkomst en daarom is het doel van ons onderzoek om de interactie tussen T-cellen en tumorcellen te onderzoeken om een beter begrip van die interacties te creëren.

Verbetering van de radiogevoeligheid, met name bij radioresistente tumoren door radiotherapie te combineren met kinaseremmers. Het aanpakken van de DNA-schaderespons is momenteel een centraal onderdeel van de recente ontwikkelingen. Driedimensionale celcultuurmodellen en co-cultuurmodellen worden momenteel ontwikkeld op het gebied van radiobiologie om de vergelijkbaarheid tussen in vitro en in vivo gegevens te vergroten.

[Verteller] Verkrijg om te beginnen HSC4-tumorcellen in een geschikt volume D10-medium. Zaai ten minste drie putjes per toestand, elk met 15.000 cellen in 200 microliter medium in platen met 96 putjes. Wijs één plaat aan voor monsterbehandeling, inclusief putjes voor alleen tumorcellen en alleen T-celcontrole en putjes voor celtelling voor elke behandeling op de co-cultuurdag. Behandel de tumorcellen op dag twee met kinaseremmers in de vereiste concentraties. Bestraal één plaat na drie tot vier uur en dezelfde na 24 uur incubatie met vijf grijze voor gehypofractioneerde bestraling. Voor perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC-isolatie, brengt u het EDTA-gemengd bloed dat bij een gezonde donor is verzameld, over in twee centrifugatiebuizen van 50 milliliter. Vul beide centrifugatiebuisjes tot 50 milliliter met PBS en 2% FBS. Bereid vervolgens zes centrifugatiebuizen met plastic inlays voor PBMC-scheiding voor. Vul elk met 15 milliliter koud dichtheidsgradiëntmedium. Bedek de media met dichtheidsgradiënt voorzichtig met 12 tot 15 milliliter verdund bloed. Centrifugeer de buisjes bij 1.200 G gedurende 10 minuten zonder te vertragen. Breng het bovenstaande na het centrifugeren over in vier nieuwe centrifugatiebuizen van 50 milliliter. Gooi de gebruikte tubes weg. Vul de nieuwe centrifugeerbuisjes tot 50 milliliter met PBS en 2% FBS en centrifugeer 10 minuten bij 120 G bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg. Resuspendeer de celpellet in één milliliter PBS met 2% FBS en combineer de twee pellets tot één valkenbuis. Vul de centrifugatiebuis weer tot 50 milliliter met PBS met 2% FBS. Centrifugeer de PBMC's gedurende 10 minuten bij 300 G. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg. Resuspendeer de celpellet in 80 microliter MACS plus buffer per 10 tot de macht van zeven cellen. Voeg 20 microliter CD8-microbeads per 10 toe aan de macht van zeven cellen en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Was de cellen na incubatie met twee milliliter MACS plus buffer per 10 tot de macht van zeven cellen. Centrifugeer de buis bij 300 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het weggooien van het supernatant, suspendeer je de cellen in 1000 microliter MACS plus buffer. Plaats twee MS kolommen in de magneet en plaats er twee centrifugatiebuisjes van 15 milliliter onder. Breng de kolommen in evenwicht met 500 microliter MACS plus buffer. Laad vervolgens een gelijk volume van de celsuspensie in de voorbereide MS-kolom. Spoel de kolommen drie keer met 500 microliter MACS plus buffer. Label de uiteindelijke verzamelde cellen als doorstroom of CD8-negatief en combineer ze in één enkele centrifugatiebuis. Neem vervolgens een nieuwe centrifugatiebuis van 15 milliliter met het label CD8-positieve T-cellen. Spoel beide kolommen met magnetisch gelabelde CD8-positieve T-cellen met elk 1000 microliter MACS plus buffer. Voordat u de T-cellen kleurt, centrifugeert u ze gedurende vijf minuten bij 300 G. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet in 1000 microliter PBS. Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 300 G gedurende vijf minuten. Na het weggooien van het supernatant, suspendeert u de celpellet in 2000 microliter van één micromolaire CFSE-kleuringsoplossing. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de gekleurde cellen gedurende vijf minuten bij 300 G. Na het wassen van de cellen met PBS, suspendeer ze opnieuw in T-celmedium. Zaai de cellen in de CD3 en CD28 gecoate plaat met zes putjes en incubeer. Oogst op dag vier de T-cellen en suspendeer ze opnieuw in hun respectievelijke medium. Voeg het gewenste aantal T-cellen toe aan de tumorcelputjes in een verhouding van één op één na het tellen van de aangewezen putjes. Verwijder op dag zeven de kweekplaat uit de incubator voor kwantificering van de proliferatie van T-cellen. Na het wassen van de cellen, kleurt u ze met de gewenste antilichamen en voert u flowcytometrie uit om de T-cellen te beoordelen. Sluit de doubletpopulatie uit op basis van het voorwaartse spreidingsgebied versus de voorwaartse spreidingshoogte om singlets te verkrijgen. Teken de singlets om T-cellen te identificeren op basis van het voorwaartse verstrooiingsgebied versus het zijverstrooiingsgebied. Zet de CD3-expressie uit tegen het verstrooiingsgebied aan de zijkant om T-cellen te onderscheiden. Identificeer verder CD8-positieve T-cellen na het uitzetten van het CD8-signaal tegen het zijverstrooiingsgebied. Alle T-cellen moeten CD3 en CD8 tot expressie brengen. Teken het CFSE-signaal van alle CD8-positieve T-cellen uit als een histogram. Nadat u de poortstappen hebt voltooid, selecteert u CD8-positieve T-cellen als invoer en analyseert u hun CD25- of HLA-DR-isotype-expressie door de fluorescentie van de respectieve oppervlaktemarkering uit te zetten tegen het zijverstrooiingsgebied. Het aandeel proliferatieve T-cellen nam toe wanneer ze samen werden gekweekt met bestraalde HSC4-tumorcellen. Bestralingstherapie of RT en RT plus remming van ATR verbeterden de proliferatie van T-cellen significant in vergelijking met RT plus ATM-remming. Van de zeer proliferatieve T-cellen was RT plus ATR-remming het meest effectief in het stimuleren van proliferatie. Expressie van CD25 op T-cellen werd gedownreguleerd na co-cultuur met RT-behandelde HSC4-tumorcellen. Voorbehandeling van tumorcellen met alleen ATM-remmer verminderde de CD25-expressie significant in vergelijking met ATR-remmer. De combinatie van RT en ATM-remmer resulteerde in verhoogde CD25-expressie in vergelijking met RT plus ATR-remmer. HLA-DR-expressie op T-cellen werd over het algemeen opgereguleerd door RT. Co-cultuur met HSC4-cellen voorbehandeld met RT plus ATR-remmer verhoogde de HLA-DR-expressie verder in vergelijking met RT alleen of RT plus ATM-remmer.