High-throughput beeldvormings- en analyseworkflow voor het evalueren van fenotypes en proliferatietoestanden van huidcellen in weefselmonsters
October 31st, 2025
De combinatie van iteratief-bleken-extends-multiplexity (IBEX) en een commerciële nucleotide-labelingtest (Click-iT EdU) maakt de detectie en categorisatie van delende celtypen mogelijk in zeer dynamische processen in gefixeerde ingevroren muizenweefselsecties. Bovendien biedt een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer.
Dit protocol combineert de multiplex optische beeldvormingsmethode, IBEX- en Click-iT EDU-labeling om delende celtypen te detecteren en te categoriseren in zeer dynamische processen, zoals huidherstel. Bovendien bieden we een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn voor beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer. Smeer de plaat met 24 putjes in met 200 microliter chroomaluminiumgelatine en incubeer de plaat gedurende 15 minuten op een rocker shaker.
Verwijder vervolgens de gelatine volledig en droog de gecoate putjes 60 minuten in een oven van 40 graden. Snijd het OCT-ingebedde weefsel met een dikte van 15 tot 30 micrometer bij de cryostaat en breng het snel over in een gecoate put met twee milliliter PBS. Verwijder de PBS voorzichtig met behulp van een pipet van één milliliter om het weefselgedeelte in het midden van de put te houden.
Om dit effectief te doen, zuigt u de PBS langzaam op vanaf de randen van de put en past u de pipetpositie indien nodig aan om te voorkomen dat het weefsel verschuift. Droog de weefselcoupes een uur in een oven van 37 graden Celsius. Rehydrateer met één milliliter PBS gedurende vijf minuten.
Permeabiliseer het weefsel met 500 microliter 0,5%Triton gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de tissue twee keer kort met PBS en voer de Click-iT-reactie gedurende 30 minuten uit bij kamertemperatuur. Houd de monsters beschermd tegen licht.
Was de tissue twee keer kort met PBS. Blokkeer gedurende een uur met een blokkeerbuffer bij kamertemperatuur. Voeg de primaire antilichamen voor de eerste cyclus toe.
En broed de plaat een nacht uit bij vier graden Celsius. Drie keer wassen met PBS. Voer de secundaire antilichaamkleuring uit.
Breng voor de eerste cyclus de secundaire antilichamen voor de ontkoppelde primaire antilichamen aan samen met een nucleaire tegenkleuring. Incubeer de monsters beschermd tegen licht gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Was de tissue drie keer met een milliliter PBS gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Laat ongeveer 500 microliter PBS in elk putje en breng de plaat naar de microscoop. Klik in de Meta Express-software op Screening en vervolgens op Acquisitie-instellingen. Klik op de knop Uitwerpen.
Reinig de bodem van de plaat met 70%ethanol en plaats de plaat in de microscoop. Klik op de knop Laadplaat. Selecteer op het tabblad Objectief en camera de gewenste vergroting.
Selecteer als acquisitiemodus de confocale spleetmodus van 51 micrometer. Selecteer op het tabblad Plaat het plaatmodel. Ga naar het tabblad Sites voor platen.
Klik onder Site-opties op een vast aantal sites. Stel het aantal kolommen en rijen zo in dat ongeveer de hele put bedekt is. Klik op de overlappende sites 10%Selecteer alleen de eerste put voor acquisitie door met de rechtermuisknop op de overeenkomstige put op de plaatkaart te klikken.
Ga naar het tabblad Autofocus voor acquisitie. Voor een well-to-well autofocus selecteert u de optie plaat en putbodem. Selecteer de optie Alle sites voor autofocus van de site.
Ga naar het tabblad Golflengten en kies het aantal kleurstoffen dat in de huidige cyclus moet worden afgebeeld. Ga naar het tabblad met de eerste golflengte. Kies laser met Z-offset voor de Z-positionering en klik op de knop Offset berekenen om de juiste beeldhoogte in te stellen.
Kies de afbeelding waarop het voorbeeld het beste is scherpgesteld. Druk op de focusknop. Er wordt een scherp beeld van het weefsel getoond.
Stel het verlichtingsvermogen in op 50%Stel de maximale doelintensiteit in op 2000 en druk op Auto Expose. Kies voor de Z-serie de Z-serie en het 2D-projectiebeeld en voor schaduwcorrectie kiest u alleen FL-arcering. Herhaal de stappen voor andere golflengten, maar in plaats van laser met Z-offset, kiest u Z-offset uit W1 en kiest u nul.
Ga naar de stap van de Z-serie en voer de gewenste stapgrootte in. Klik op de knop Focus. Sleep de pijl voor de huidige positie totdat de onderkant van het weefsel is bereikt en klik op de knop Set B.
Sleep de positiepijl naar de bovenkant van het weefsel en klik op de knop Instellen T. Klik op F2, Stop, druk nogmaals op Start Live. Zorg ervoor dat de fase zich bij de eerste put bevindt door er met de linkermuisknop op te klikken.
Zoek de rand van het weefsel en markeer alle plaatsen die weefsel bevatten voor acquisitie door met de rechtermuisknop te klikken. Ga naar het tabblad Uitvoeren en typ de naam van de plaat. Klik op Protocol opslaan.
Stel het acquisitiegebied in voor alle andere putten. Voer Control, Journal uit, begin met opnemen en start vervolgens onmiddellijk Control, Journal, stop met opnemen. Sla het aangemaakte dagboek op en open het opnieuw via Control, Journal, Edit Journal.
Ga in het linkerdeelvenster naar Plaatacquisitie, laad protocol uit bestand en klik op Plaatacquisitie om die stappen aan het dagboek toe te voegen. Dubbelklik op de Edit Plate Acquisition, laad het protocol uit het bestand en kies het protocol dat voor de eerste put is opgeslagen. Herhaal de stappen voor elke put die moet worden verkregen en zorg ervoor dat u altijd het respectieve protocol laadt.
Klik op Run Journal om de acquisitie te starten. Begin 30 minuten voor het einde van het dagboek met het voorbereiden van het bleekreagens. Los 10 milligram lithiumboorhydride op in 10 milliliter dubbel gedestilleerd H2O en passeer door een filter van 0,22 micrometer.
Laat 10 minuten intrekken. De oplossing moet belletjes beginnen te vormen. Om een efficiënt bleken te garanderen, gebruikt u het bleekreagens binnen vier uur na bereiding.
Voeg de bleekoplossing toe aan de monsters en incubeer gedurende 15 minuten terwijl u de monsters blootstelt aan omgevingslicht. Er moeten kleine belletjes op het weefsel verschijnen. Was de gebleekte monsters drie keer met een milliliter PBS gedurende vijf minuten, elk op kamertemperatuur.
Voeg de primaire antilichamen toe voor de volgende cyclus en broed een nacht bij vier graden Celsius. Gemultiplexte IBEX-beeldvorming in combinatie met Click-iT EDU-labeling onthult verschillende structuren en prolifererende celtypen in de gewonde huid. EDU-labeling op gecryopreserveerde monsters blijkt vergelijkbaar te zijn bij het uitvoeren van antilichaamimmunofluorescentie-labeling voor KI-67 op in paraffine ingebedde weefselsecties, evenals het labelen van cellen met KI 67 met behulp van flowcytometrie.
Het gebruik van dit protocol maakt een nauwkeurige detectie van celproliferatie in complexe biologische processen mogelijk. Bovendien vereist de open source beeldverwerkingspijplijn geen programmeerervaring en genereert het bestanden die kunnen worden verwerkt met niet-commerciële software, zoals Fiji en quPath. Bovendien vereist dit protocol geen dure apparatuur en kan het daarom in de meeste onderzoeksomgevingen worden uitgevoerd.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de combinatie van de iteratieve-bleaching-extends-multiplexity (IBEX) en Click-iT EdU labeling om delende celtypen te detecteren en categoriseren in zeer dynamische processen, met name in muishuidreparatie. De ontwikkelde open-source beeldverwerkingspijplijn vergemakkelijkt hoogdoorvoerige beeldacquisitie en analyse.
Belangrijke Studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Celdeling en categorisering
- Dynamische biologische processen
- Hoogdoorvoerige beeldtechnieken
Achtergrond
- Belang van beeldvorming in het begrijpen van celproliferatie
- Behoefte aan effectieve weefselverwerkingsmethoden
- Eerdere beperkingen in multiplex beeldvormingsbenaderingen
Gebruikte Methoden
- Multiplex optische beeldvormingsmethode en Click-iT EdU labeling
- Gefixeerde bevroren muisweefselsecties
- Hoogdoorvoerige beeldacquisitietechnologie
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle detectie van differentiërende celtypen betrokken bij huidreparatie
- Accurate beeldvorming van cellulaire proliferatie met behulp van nieuwe technieken
- Vergelijking met traditionele antilichaam immunofluorescentie methoden
Conclusies
- Toont een effectieve aanpak voor het bestuderen van celproliferatie in complexe biologische contexten
- Biedt een waardevol hulpmiddel voor biologisch onderzoek zonder programmeerkennis te vereisen
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput multiplexed imaging of skin tissue enables precise evaluation of cell phenotypes and proliferation states, addressing a critical gap in regenerative biology and tissue repair research. The integration of IBEX with Click-iT EdU chemistry and automated confocal imaging enhances predictive confidence in cell state characterization and supports robust target validation in early discovery. This workflow positions biopharma teams to make informed, risk-adjusted decisions in regenerative medicine and tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of regenerative cell populations and their proliferation dynamics.
- Supports functional target validation by distinguishing actively dividing cell types in situ.
- Improves predictive confidence for pathway analysis in tissue repair models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue sections for multiplexed imaging assays.
- Standardizes quantitative assessment of proliferation markers across multiple cell types.
- Enables scalable, reproducible imaging workflows suitable for high-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant regenerative processes in preclinical models.
- Provides continuity from discovery-stage cell state analysis to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative medicine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and robust cell state quantification in tissue samples.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying cell proliferation and phenotype changes during tissue repair.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content, multiplexed readouts for comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissue contexts.
- Enterprise Reuse: Offers an open-source, adaptable imaging and analysis pipeline for broad R&D deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in regenerative cell state analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in regenerative medicine.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue repair and cell therapy programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and tissue handling.
- Needs access to automated spinning disk confocal microscopy and compatible imaging software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various tissue types and regenerative models with protocol optimization.
- Limited by the need for careful reagent handling and iterative imaging cycles.
