Een methode voor 2-Photon Imaging van de bloedstroom in de neocortex door middel van een Cranial Window

De mogelijkheid om de cerebrale vaatvoorziening te beelden en de bloedstroomdynamiek in de intacte hersenen van levende knaagdieren op te nemen, is een krachtige techniek die kan worden toegepast op de studie van cerebrale ischemie of normale hersenfysiologie. Hier zullen we demonstreren hoe twee fotomicroscopie te gebruiken om de bloedstroomdynamiek in de neocortex van levende muizen te beelden met behulp van fluorescerende kleurstoffen die in de staarvene worden geïnjecteerd. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door David Kleinfeld in Winfred Dank.

Hallo, ik ben Ricardo Mota van het Laboratorium van Carlos Porter Cayo in het Departement Neurologie van de Universiteit van Californië Los Angeles. In een eerder video lieten we u de methode zien voor het implanteren van een schedelvenster voor chronische beeldvormingsexperimenten in vivo. Vandaag gaan we u de procedure laten zien voor het beelden van bloedstroomdynamiek in de hersenschors door een schedelvenster.

Deze voorbereiding is erg nuttig omdat het mogelijk maakt om diep in de hersenen te beelden met behulp van fotonlasermicroscopie. Dus laten we beginnen. Om de cerebrale vaatvoorziening te beelden, moeten dieren intraveneus worden geïnjecteerd met een fluorescerende kleurstof.

We gebruiken Dexter-geconjugeerde kleurstoffen omdat de dextronmotie voorkomt dat de kleurstof de bloed-hersenbarrière passeert en uit de bloedvaten lekt. Muizen worden verdoofd met isoflurine, 4% voor inductie en 1,5 tot 2% tijdens de injectie. Vervolgens wordt de staart gedesinfecteerd met drie wattenschijfjes van 70% alcohol met een naald van 26 gauge, 75 tot honderd microliters van een 5% oplossing van R domine Dextran opgelost in zoutoplossing wordt door de staarvene geïnjecteerd.

Halverwege de schacht van de staart kunnen dieren onmiddellijk na de staarvene-injectie worden afgebeeld totdat de kleurstof in de urine wordt uitgescheiden, die roze zal worden als er ERO domine kleurstof wordt gebruikt. Ongeveer twee uur na de injectie van de fluorescerende Dexter-kleurstof wordt de muis verdoofd met isoflurine. Nogmaals, 4% voor inductie, een tot 1,5% voor beeldvorming. De muis wordt stevig bevestigd met behulp van de titaniumstaaf aan de microscoopstandaard, die een thermisch gereguleerde verwarmingspad bevat om het dier warm te houden.

Er wordt wat oogzalf aangebracht om de ogen vochtig te houden. Het dekglas van het schedelvenster wordt schoongemaakt met 70% alcohol. Het venster wordt parallel aan het brandpunt geplaatst en gecentreerd in het gezichtsveld.

Onder het viervoudige objectief is het het beste om een foto van de schedeloppervlaktevaten met een digitale camera te maken. Deze foto wordt gebruikt als referentiebeeld in volgende beeldvormingssessies om de beeldregio herhaaldelijk van dag tot dag te vinden. Het viervoudige objectief wordt vervolgens vervangen door een wateronderdompeling 40 x objectief.

Zonder de standaard te verplaatsen, wordt de digitale foto van het uitzicht genomen. Nogmaals, de coördinaten van de stage manipulator zijn ingesteld op nul. We gebruiken scan image als de beeldverwervingssoftware.

Dit werd geschreven in MATLAB door Tom Paul Rudo en Bernardo Sabatini in het laboratorium van Carls Voto. Vervolgens zetten we al het andere apparatuur aan, de laser, de vermogensmeter, de foto vermenigvuldigingsbuizen, de versterkers, enzovoort. Het gebied van het venster dat geschikt is om te worden afgebeeld, wordt kort gescand bij lage vergroting om de beste regio's te vinden.

Zodra deze zijn geïdentificeerd, wordt de stapel met lage vergroting van de gekozen regio om af te beelden genomen en worden de XY-coördinaten geannoteerd om de bloedstroomdynamiek in kleine vaten of haarvaten op te nemen. We gebruiken lijnscans langs minimaal 40 micrometer van het belangrijkste vat. Deze enkele sweeps die een seconde duren, worden gedaan met zo min mogelijk laservermogen, en de coördinaten en hoek van het scannen worden opgeschreven.

Zodra de beeldvormingssessie voorbij is, wordt het dier verplaatst naar een warme kamer waar het kan herstellen van de verdoving. Hier laten we een stapel van honderd beelden zien die elke vijf micrometer zijn genomen met onze twee-fotonmicroscoop door een schedelvenster geplaatst over de somatosensorische cortex van een vijf maanden oude muis die werd geïnjecteerd met r Domine dextran door de staarvene. Deze reeks beelden toont het complexe netwerk van grote en kleine bloedvaten, inclusief haarvaten.

We hebben u zojuist een methode laten zien voor visualisatie van bloedstroomdynamiek in vivo door een schedelvenster. Dit is een uiterst krachtige methode voor het beelden van cerebrale bloedstroomdynamiek in de corticale vaatvoorziening, bijvoorbeeld om veranderingen in de bloedstroom na een beroerte te onderzoeken. Meervoudige beelden kunnen op verschillende tijdstippen in BUL's worden gedaan door herhaalde staarvene-injecties van de fluorescerende kleurstof te gebruiken.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om in de schoonste en meer steriele omstandigheden mogelijk te werken en om een zeer vaste hand te hebben. Oké, en dat is het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.