Gewijzigde Most Probable Number Assay om salmonella in rauwe en kant-en-klare kipproducten te kwantificeren

Ons onderzoek ontwikkelt snelle detectie-, kwantificerings- en karakteriseringstechnologieën voor door voedsel overgedragen ziekteverwekkers, met de nadruk op gevoelige methoden die de voedselveiligheid kunnen verbeteren door identificatie van een besmetting in de echte wereld. Belangrijke uitdagingen zijn onder meer het bereiken van snelle gevoelige detectie en complexe matrices met goedkope, maar schaalbare oplossingen. We pakken ook problemen aan bij het verminderen van valse positieven en het verbeteren van de compatibiliteit met diverse testomgevingen.

Voor de voedselveiligheid betekent dit het nauwkeurig detecteren van ziekteverwekkers bij lage concentraties in verschillende voedselmatrices. Ons protocol pakt de kloof tussen prevalentiedetectie en kwantificering van salmonella aan om deterministische waarden te bieden voor de mate van besmetting in voedingsproducten. Het proces is minimaal storend omdat het gevalideerde tests bevat die worden gebruikt in FSIS-protocollen en flexibel genoeg is om extra pathogenen en voedselmatrices op te vangen.

Plaats om te beginnen de gemalen kip die is verkregen van de afdeling vers vlees van lokale retailers op een werkend platform. Verdeel het vlees aseptisch in monsters van 25 gram. Koop kant-en-klare kipproducten uit de diepvriesafdeling van lokale retailers en verdeel ze aseptisch in monsters van 25 gram.

Streep salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 op een vijzelplaat van een hersenhartinfuus. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Inoculeer de volgende dag 25 milliliter bouillon voor hersenhartinfusie met een kolonie vers gekweekte salmonella.

Aeroob kweekcultuur 's nachts bij 37 graden Celsius met schudden bij 100 RPM. Om een reeks tienvoudige verdunningen te bereiden, brengt u 0,5 milliliter cultuur over in 4,5 milliliter gebufferd peptidewater of BPW en mengt u grondig. Breng vervolgens 0,5 milliliter van de bereide verdunning over in 4,5 milliliter BPW voor elke volgende verdunning.

Breng vervolgens 25 gram doorstraalde gemalen kip aseptisch over in steriele maagzakken. Inoculeer het monster met één milliliter van de gewenste concentratie van de cultuurverdunning. Verdeel het inoculum met behulp van een steriele celspreider voorzichtig gelijkmatig over het oppervlak van de kip en laat ze een uur op vier graden Celsius staan.

Na het uitbroeden van bestraalde gemalen kippenmonsters met salmonellacultuur gedurende een uur, voegt u 225 milliliter BPW toe aan elk monster om de gewenste verhouding tussen monster en media te bereiken. Homogeniseer de kippenmonsters met behulp van de maag op een normale snelheid gedurende 120 seconden. Verwijder met een pipet van 50 milliliter voorzichtig de vloeistof van de gefilterde kant van de stomacher en verdeel deze in twee steriele centrifugeflessen.

Centrifugeer de monsters gedurende 10.000 minuten bij 10.000 G en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de celpellet in drie milliliter BPW met behulp van een steriele spatel. Voeg 12 milliliter BPW toe aan de geresuspendeerde pellet en meng grondig door te roeren met een steriele spatel.

Combineer de inhoud van beide centrifugeflessen tot één fles. Voeg drie milliliter van het geresuspendeerde monster toe aan elk putje in kolom één van het blok met 48 putjes om acht replicaten te maken. Om een reeks tienvoudige verdunningen over de kolommen één tot en met zes te bereiden met behulp van een achtkanaalspipet, voegt u 0,3 milliliter van het monster van elke put toe aan 2,7 milliliter BPW in de volgende kolom en zorgt u ervoor dat u grondig mengt.

Incubeer blokken 's nachts bij 37 graden Celsius met schudden bij 100 RPM. De volgende dag wordt met behulp van een meerkanaals pipet zeven microliter cultuur van elke verdunning op de vijzelplaten van de hersenhartinfusie in een raster van vier bij zes geschept. Laat de platen 10 minuten drogen voordat je ze 18 tot 24 uur bij 37 graden Celsius incubeert.

Onderzoek na de incubatie de vijzelplaten, waarbij ten minste één kolonie als positief en geen enkele groei als negatief wordt gemarkeerd. Voer het aantal verdunnings- en verdunningsfactoren in een werkblad in. Voer het juiste volume of gewicht van het monster in.

Geef vervolgens het aantal replicaten op en voer het aantal monsters in dat positief is getest. Klik op resultaten berekenen om geannoteerde positieve en negatieve resultaten te analyseren met behulp van de eenvoudige methode voor het oplossen van maximale waarschijnlijkheid. Stel om te beginnen het MPN-blok met 48 putjes in voor salmonellacultuur die is geïnoculeerd met kippenmonsters.

Meng culturen in een blok van 48 putjes door meerdere keren op en neer te pipetteren. Breng 200 microliter van elke cultuur over in een PCR-plaat met 96 putjes. Sluit de plaat af en centrifugeer op 6.600 G gedurende 10 minuten.

Verwijder het bovenstaande en voeg 20 microliter van het reagens van de DNA-extractiekit toe aan de pellet. Meng de pellet door op en neer te pipetteren. Sluit de plaat opnieuw af en verwarm deze 10 minuten op 99 graden Celsius, gevolgd door afkoeling tot 20 graden Celsius.

Gebruik na het centrifugeren twee microliter van het bovenstaande om het QPCR-mengsel te bereiden volgens het vastgestelde protocol. Voer onder de volgende voorwaarden de real-time PCR uit. Exporteer na PCR de resultaten en beschouw de putjes met cyclusdrempelwaarden kleiner dan of gelijk aan 30 als positief en groter dan 30 als negatief.

Meng culturen in een blok van 48 putjes door meerdere keren op en neer te pipetteren. Breng 20 microliter van elk monster over in de meegeleverde lysisbuis van de salmonellakit voor moleculaire detectietest. Verwarm de samples gedurende 15 minuten op 100 graden Celsius.

Incubeer de monsters vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Breng 20 microliter lysaat uit elke lysisbuis over in een reagensbuis en laad de reagensbuisjes in de houder. Voeg de houder met reagensbuisjes toe aan het instrument van het moleculaire detectiesysteem.

Configureer de software-instellingen voor de test van het moleculair detectiesysteem. Voer de test uit en exporteer het rapport voor analyse. Het MDS Run-rapport bevat gedetailleerde uitvoerinformatie, die positief of negatief is.