Geautomatiseerde en high-throughput microbiële monoklonale teelt en plukken met behulp van het eencellige Microliter-druppel Culture Omics-systeem

Dit onderzoek verkent microbiële cultuuromics, met behulp van een automatisch platform, om microbiële isolatie, teelt en monoklonale screening te verbeteren. Het doel is om het begrip van de menselijke darm, het microbioom en hun toepassingen te verbeteren. Technologen die microbioomonderzoek bevorderen, omvatten het laten vallen van microfluïdica, automatische stamisolatie- en screeningplatforms, machine learning-algoritmen en monoklonale dispensers voor hooggespannen cultuuromics en microbioomanalyse.

Het middencelsysteem verbetert de microview, monoklonale isolatie en kleuring aanzienlijk, waardoor bijna het dubbele aantal klonen wordt gegenereerd in vergelijking met traditionele methoden, waardoor de onderzoekscapaciteit in de darmmicroview-cultuurmix wordt bevorderd. Dit protocol komt tegemoet aan de behoefte aan een goedkoop, ondersteunend microbieel screeningsplatform met hoge ondersteuning, waarbij de beperkingen van traditionele methoden op het gebied van efficiëntie en scorebaarheid voor onderzoek naar cultuurmixen worden overwonnen. Ons lab zal zich verder richten op de integratie van aanvullende technische aspecten van druppelmanipulatie, zoals het splitsen en samenvoegen van druppels om de reikwijdte van technologische toepassingen uit te breiden.

Open om te beginnen de druppelgeneratie- en kweekkamerdeur van de MISS-cel. Verwijder verticaal de beschermkap voor de microslangen en de druppelgenererende microfluïdische chip. Voeg met behulp van een wegwerpspuit 10 milliliter steriel gedestilleerd water toe aan de luchtbevochtiger in de kamer en plaats de beschermkap terug.

Open de steriele verpakking van de microslangen en druppelgenererende microfluïdische chip en plaats deze verticaal direct boven de kweekkamer. Klik vervolgens op de software-interface op installatie. Wanneer het bevestigingspop-upvenster verschijnt, klikt u op ja om de installatie te starten.

Haal de luchtbellenverwijderaar eruit en bevestig deze ondersteboven op de plaatsing van de luchtbellenverwijderaar in de kamer. Bevestig de druppeluitlaatbuis van de luchtbellenverwijderaar aan het klemventiel eronder. Leid het door het geheel dat naar de druppeldetectie- en verzamelkamer leidt.

Steek na het openen van de deur van de kamer de detectiebuis verticaal in de detectiehouder. Zorg ervoor dat de detectiebuis volledig is ingebracht. Draai de schroef waarmee de detectiebuis is bevestigd met de klok mee vast.

Nadat u het volledig inbrengen en vastzetten hebt bevestigd, sluit u de deur van de kamer. Sluit elk van de 10 siliconenslangen van de microfluïdische chip, gelabeld L1 tot en met L10, aan op de bijbehorende genummerde klemkleppen. Sluit vervolgens de snelkoppeling van de microfluïdische chip aan op de overeenkomstige poort op het omic-systeem, volgens de juiste aansluitingen.

Zodra de chipinstallatie is voltooid, verschijnt er een pop-upvenster met de melding dat de klemklep van de druppelslang is geopend. Klik op OK wanneer de installatie van de microslangen en de druppelgeneratiechip is voltooid. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat alle buizen correct zijn bevestigd aan de bijbehorende klemkleppen, klikt u op OK.

Voordat u de initialisatie uitvoert, klikt u op de instellingsinterface om de relevante parameters te configureren, zoals selectieve modus, incubatietemperatuur, incubatietijd, roerwerksnelheid, OD-detectiegolflengte en excitatie- en emissiegolflengte voor fluorescentiedetectie. Navigeer naar de startinterface en klik op initialiseren. Het pop-upvenster ter bevestiging verschijnt, klik op ja om het IC-systeem een zelfcontrole van zijn componenten te laten uitvoeren, inclusief de injectiepomp, temperatuurinstellingen, testen van de afvoer van afvalvloeistof, de screeningmodule en de druppeldetectiemodule.

Nadat de initialisatie is voltooid, klikt u op OK in het pop-upvenster. Om het monster voor te bereiden, neemt u het microbiële monster en voert u seriële verdunning uit met het overeenkomstige medium om een concentratie van ongeveer 50 cellen per milliliter te bereiken om een monstersuspensie van 40 milliliter te verkrijgen. Draai vervolgens de dop van de monsterfles los en giet de verdunde fecale suspensie in de fles met een magnetische roerstaaf, tot aan de positie voor het toevoegen van monsters.

Draai de dop vast en draai deze stevig vast. Steek vervolgens snelkoppeling A in snelkoppeling B om het laadproces van het monster te voltooien. Nadat u de monsterfles op de daarvoor bestemde positie hebt geplaatst, scheidt u de snelkoppelingen A en B van de monsterfles.

Sluit snelkoppeling A van de monsterfles aan op de O3-poort op het omic-systeem. Sluit de C3-connector op de microfluïdische chip aan op snelkoppeling B en sluit de deur van de kamer. Selecteer op de startinterface van de software het gewenste aantal druppelslangen dat moet worden gegenereerd en klik op produceren om het genereren van druppels met één cel te starten.

Wacht op het pop-upvenster dat aangeeft dat het maken van de druppels is voltooid en klik op OK. Sluit de klem op de drie connectoren en verwijder de monsterfles. Selecteer in de startinterface van de software hetzelfde aantal druppelslangen dat wordt gebruikt tijdens het genereren van druppels.

Klik op cultuur. Bevestig de kweektijd en temperatuur en begin met het proces. Wacht op het pop-upvenster dat aangeeft dat de druppelteelt is voltooid.

Druk op de UV-knop op het omic-systeem om ultraviolet UV-licht in te schakelen. Bestraal de druppeldetectie- en opvangkamer gedurende 30 minuten voordat u deze uitschakelt. Open in een superschone bank alle 96 putplaten die worden gebruikt voor het verzamelen van druppels en stapel ze op elkaar zonder deksel, waarbij je ze opeenvolgend van onder naar boven nummert.

Zorg ervoor dat de bovenste putplaat is afgedekt met een deksel. Open de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer en plaats de putplaten op de daarvoor bestemde posities. Verwijder het deksel van de bovenste putplaat en sluit vervolgens de kamerdeur.

Schakel het UV-licht op het omic-systeem opnieuw gedurende 30 minuten in om secundaire sterilisatie uit te voeren. Verwijder vervolgens de luchtbellenverwijderaar uit de stand. Draai de dop los en verwijder de vlindervormige schroef van de dop.

Giet 200 milliliter olie voor het verwijderen van luchtbellen in de luchtbellenverwijderaar. Zet de dop stevig vast en bevestig de luchtbellenverwijderaar vervolgens ondersteboven op de daarvoor bestemde plaats. Selecteer op de startinterface de druppelslang om te sorteren.

Klik op sorteren. Voer het aantal putplaten in dat moet worden verzameld en start het sorteerproces. Observeer het procesweergavegebied voor real-time metingen van de optische dichtheid van druppels of fluorescentiewaarden.

Analyseer ongeveer 20 tot 30 druppels om de OD-waarde te controleren. Als de meeste druppels een OD van ongeveer 0,2 hebben, stelt u de onderste OD-drempel in op 0,5 en de bovenste OD-drempel op vier. Het systeem verzamelt automatisch druppels binnen dit bereik in de platen met 96 putjes.

Wacht op het pop-upvenster dat aangeeft dat het sorteren en verzamelen van druppels is voltooid en klik vervolgens op OK. Open de deur van de druppeldetectie- en verzamelkamer. Plaats het deksel van de putplaat op de bovenste putplaat en verwijder de platen samen.

Klik op gegevens exporteren om de verzamelde druppelsignaalgegevens op te slaan. Klik op de heatmap. Selecteer het gegevensbestand voor het verzamelen van druppels en observeer de OD die wordt weergegeven in het microplaatformaat.

Visualiseer deze OD-waarden als een heatmap waarbij de kleurintensiteit overeenkomt met de OD-verdeling over de putten, waardoor een duidelijke en intuïtieve weergave ontstaat. De soortendiversiteit van de menselijke darmmicrobiota verkregen uit het omic-systeem, de vaste-plaatmethode en het eerste ontlastingsmonster werden op familieniveau vergeleken. 34 microbiële families werden verrijkt met zowel de solid plate-methode als de gedemonstreerde OMICS-methode, waarbij het OMIC-systeem bovendien vier families verrijkte.

Het omic-systeem verrijkte ook effectief enkele van de families met een lage abundantie. Op genusniveau verrijkten beide methoden 74 microbiële geslachten, terwijl de MISS-celmethode bovendien 13 geslachten verrijkte. Bovendien werden twee geslachten die aanvankelijk in lage aantallen aanwezig waren, effectief verrijkt met behulp van het OMIC-systeem.

Deze resultaten toonden aan dat de MISS-celkweekmethode betere groeiomstandigheden bood voor die stammen die in lage hoeveelheden aanwezig waren of slechte groeiprestaties hadden in de oorspronkelijke microbiële suspensie.