Op fluorescentie gebaseerde detectie van FEN1-nuclease-activiteit en screening van kleinmoleculaire remmers

We ontwikkelden een op fluorescentie gebaseerde methode om FEN1-nuclease-activiteiten te detecteren en de kleinmoleculaire remmers te screenen, waardoor de diagnostiek en gericht therapeutisch onderzoek werden bevorderd.

De huidige uitdagingen op het gebied van expressie zijn onder meer de complexiteit en de veiligheidsproblemen van conventionele methoden, samen met de hoge kosten en gespecialiseerde apparatuur die nodig zijn voor bestaande op fluorescentie gebaseerde technieken.

Dit protocol pakte de tekortkomingen van de traditionele radiologische methode en dure fluorescentietechnieken aan en bood een veiligere, efficiëntere en gebruiksvriendelijke detectieoplossing.

Ons laboratorium zal zich richten op de optimalisatie van een high-throughput screeningplatform om in vivo toepassingen en mechanismen van FEN1-remmers in kankertherapie te onderzoeken.

[Docent] Ontwerp om te beginnen DNA-oligonucleotidestrengen op basis van de specifieke splitsingsactiviteit van FEN1. Meng de enkelstrengs DNA-oligonucleotiden in een gloeibuffer. Voeg 10 microliter gloeibuffer en gedeïoniseerd water toe om een totaal volume van 50 microliter te maken. Verwarm het reactiemengsel vervolgens gedurende een minuut op 100 graden Celsius in een metaalbad. Breng de buis onmiddellijk over naar 72 graden Celsius en incubeer gedurende 10 minuten. Schakel vervolgens de warmtebron uit en laat de oplossing geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur om het volledige dubbelstrengs DNA-substraat te vormen. Voor de FEN1-nuclease-activiteitstest combineert u eerst twee microliter van het DNA-substraat met FEN1-nuclease in de reactiebuffer. Incubeer het reactiemengsel in een metalen bad bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg 20 microliter 2X beëindigingsbuffer toe om de reactie te stoppen. Laad vervolgens 20 microliter van het beëindigde monster op een vooraf voorbereide 12% denaturerende polyacrylamidegel. Elektroforeer de gel op 100 volt gedurende 60 minuten. Eenmaal voltooid, visualiseert u de elektroforeseresultaten onder een fluorescentiebeeldvormingssysteem. Breng met een pipet twee microliter dimethylsulfoxide over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg twee microliter FEN1-nuclease en 10 microliter 2X reactiebuffer toe aan de buis en zes microliter gedeïoniseerd water. Meng de oplossing grondig en incubeer deze vervolgens 10 minuten op ijs. Na incubatie pipetteer je twee microliter DNA-substraat om een eindreactievolume van 20 microliter te bereiken. Bereid vervolgens een werkende verdunning van de FEN1-nucleaseremmer FEN1-IN-4 door een tweevoudige seriële verdunning uit te voeren van een oplossing van één molaire stam in dimethylsulfoxide. Pipetteer twee microliter FEN1-nuclease en de verdunde FEN1-IN-4-remmer in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Piket vervolgens 10 microliter 2X reactiebuffer en vier microliter gedeïoniseerd water. Meng voorzichtig en incubeer het mengsel 10 minuten op ijs. Voeg nu twee microliter DNA-substraat toe aan de buis om het uiteindelijke volume op 20 microliter te brengen. Incubeer het reactiemengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in een metaalbad. Beëindig vervolgens de reactie door 20 microliter beëindigingsbuffer toe te voegen. Een heldere eiwitband van ongeveer 45 kilodalton bevestigde succesvolle zuivering van de FEN1-nuclease van geïnduceerde expressie. Het fluoresceïne-gelabelde dubbelstrengs DNA-substraat verscheen bij 80 kilodalton, wat een succesvolle synthese bevestigt in vergelijking met het enkelstrengs substraat bij 59 kilodalton. FEN1-nuclease splitste het 80-nucleotide, dubbelstrengs DNA-substraat op een dosisafhankelijke manier, met volledige splitsing waargenomen bij 0,5 microgram per microliter. De FEN1-IN-4-verbinding remde de splitsing van dubbelstrengs DNA-substraat door FEN1 aanzienlijk, zoals blijkt uit de retentie van de 80-nucleotideband. FEN1-IN-4 verminderde de FEN1-nuclease-activiteit op een concentratieafhankelijke manier, met een maximale remmende concentratie van de helft van 14,03 micromolair.