Genoombrede CRISPR-screening voor het onthullen van stralingsgevoelige en radioresistente genen

Dit onderzoek richt zich op genoombrede CRISPR-screening en radiotherapie. We bieden een protocol om radiogevoelige en radioresistente genen te bekijken met behulp van een genoombrede CRISPR-screening in longkankercellen na bestraling. De huidige experimentele uitdagingen omvatten de off-target effecten, die worden veroorzaakt door de enorme complexiteit van het genoom en mogelijke moeilijkheden bij het onderzoeken van de onderliggende mechanismen. Vergeleken met traditionele screeningmethoden bereikt CRISPR permanente genetische modificatie en vertoont het superieure precisie, waardoor het vooral waardevol is bij functioneel genomisch onderzoek en het ontdekken van doelen. In de toekomst zal ons team zich concentreren op het bestuderen van het in vivo CRISPR-scherm om de problemen op te lossen die dit onderzoek heeft achtergelaten, en we zullen ons inzetten voor het optimaliseren van de CRISPR-technologie.

[Verteller] Pas om te beginnen de aanhangende celdichtheid aan tot vijf keer 10 tot de macht van vijf cellen per milliliter. Verdeel met behulp van een pipet twee milliliter van de celsuspensie in elk kweekschaaltje van 3,5 centimeter voor bestraling in verschillende doses. Plaats de schaaltjes in een broedmachine op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en broed een nacht in. Nummer elke kweekschaal van 3,5 centimeter van één tot vijf met behulp van een stift. Gebruik een stralingsbron om stralingsdoses van respectievelijk 2, 4, 6 en 8 gray toe te dienen aan de gerechten twee tot en met vijf. Stel de bestraalde celdichtheid in op één keer 10 tot de macht van vijf cellen per milliliter. Zaai 10 microliter per putje, wat overeenkomt met 1000 cellen per 100 microliter, in platen met zes putjes met drie replicaten per stralingsdosis. Zaai vervolgens 30 microliter per putje, wat overeenkomt met 3000 cellen per 100 microliter, in platen met 96 putjes met vijf replicaten per stralingsdosis. Meng nu het CCK-8-reagens met RPMI 1640-medium zonder FBS in een verhouding van één tot negen. Voeg het mengsel toe aan de plaat met 96 putjes en incubeer de plaat een uur in het donker. Gebruik vervolgens een microplaatlezer om de optische dichtheid op 450 nanometer te meten. Om het infectieproces te starten, stelt u een logaritmische concentratiegradiënt voor lentivirus in van nul tot 800 eenheden per milliliter. Voeg het overeenkomstige volume lentivirus toe aan twee microliter polybreen per gerecht en laat het vijf minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen. Druppel langzaam het lentivirus polybreenmengsel in elk putje. Pas de ouderlijke celdichtheid aan op drie keer 10 tot de macht van vijf cellen per milliliter en inoculeer één milliliter in elk putje van een plaat met 12 putjes. Voeg puromycine in een concentratiegradiënt toe aan de putjes. Vervang na 72 uur infectie het medium in elk putje door een volledig medium met de minimale puromycineconcentratie voor celdoding. Bereken de vermenigvuldiging van de infectie voor elke put op basis van overlevende cellen. Pas de aanhangende celdichtheid aan op één keer 10 tot de macht van zeven cellen per milliliter. Voeg lentivirus met een infectieveelvoud gelijk aan 0,3 toe aan 30 microliter per schaaltje polybreen en laat het vijf minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen. Druppel het mengsel van lentivirus en polybreen langzaam in de kweekschaal van 15 centimeter. Meng goed en incubeer het een nacht bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Zuig op de tweede dag na infectie het medium uit de kweekschaal en vervang het door 15 milliliter RPMI 1640 compleet medium dat 10% FBS bevat. Herhaal dezelfde behandeling voor de niet-geïnfecteerde oudercellen als een negatieve controle en ga door met kweken gedurende 72 uur. Verteer nu de cellen van een kweekschaaltje van 15 centimeter met 0,25% trypsine. Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 compleet medium met 10% PBS en tel het aantal cellen. Na het extraheren van het genomische DNA voor dag nul, gebruikt u een NanoDrop UV-spectrofotometer om de DNA-concentratie en -zuiverheid te meten. Dien een geschikte dosis straling toe aan cellen in de behandelingsgroep en laat de cellen van de controlegroep onbehandeld om zich normaal voort te planten. Na 14 dagen behandeling worden zowel de behandelings- als de controlegroepcellen verteerd met 0,25% trypsine. Resuspendeer de cellen in RPMI 1640 compleet medium met 10% FBS. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 G en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet in één milliliter PBS. Na het herhalen van de centrifugatiestap, extraheert u dag 14 genomisch DNA uit de pellet en bepaalt u de DNA-concentratie. Bereid vervolgens de benodigde primers voor en verdun ze tot 10 micromolair. Nadat u de componenten hebt toegevoegd om een reactiesysteem van 20 microliter op te zetten, centrifugeert u de buis kort gedurende vijf seconden op 300 G. Voor agarosegelelektroforese bereidt u de gel voor, verwijdert u de kam en vult u de elektroforesetank met voldoende buffer om de gel te bedekken. Voeg een laadbuffer toe aan het DNA-monster en meng goed. Laad ten slotte het mengsel in de putten en start de elektroforese Kolonievorming na 14 dagen toonde aan dat blootstelling aan twee Gray straling het aantal overlevende kolonies aanzienlijk verminderde in vergelijking met nul Gray. De CCKA-test toonde een substantiële afname van de levensvatbaarheid van de cellen bij two Gray met verdere afname bij hogere stralingsdoses. Behandeling met toenemende concentraties puromycine gedurende 72 uur toonde aan dat één micromolaar de minimale concentratie was die nodig was om A549-cellen te elimineren. PCR-validatie toonde verschillende banden op 231 basenparen, wat de verwachte lengte van sgRNA-sequenties in de CRISPR-bibliotheek bevestigde. Uit sequentieanalyse bleek dat ongeveer 60% van de lezingen met succes in kaart werd gebracht op het referentiegenoom. sgRNA-leestellingen volgden een Poisson-verdeling, die overeenkwam met theoretische verwachtingen voor een screening op genoomschaal. PCA- en heatmap-analyse toonden een hoge intergroepsvariabiliteit en een lage intergroepsvariatie, wat de experimentele consistentie valideerde. Genontologie-analyse identificeerde de respons op DNA-schade als een van de meest verrijkte routes in de top 15 van resultaten.