Fluorescentievisualisatie met één molecuul van DNA-polymerasedynamiek bij G-quadruplexen
April 4th, 2025
Dit protocol schetst een op fluorescentiemicroscopie gebaseerde DNA-replicatietest met één molecuul, waardoor real-time visualisatie van interacties tussen DNA-polymerasen en obstakels zoals G-quadruplex-structuren mogelijk is.
Ons werk richt zich op de ontwikkeling en het gebruik van een methodologie met één molecuul om de dynamiek in complexe biologische systemen te bestuderen. In het bijzonder zijn we geïnteresseerd in het leren hoe DNA-polymerasen zich gedragen bij het tegenkomen van wegversperringen, in dit geval G-quadruplexen. We hebben een methode met één molecuul ontwikkeld op basis van fluorescentievisualisatie waarmee we het gedrag van individuele DNA-polymerasen kunnen zien bij het tegenkomen van een G-quadruplex.
Met onze test hebben we een voorheen niet-gekarakteriseerde uitwisselingsroute voor DNA-polymerasedelta geïdentificeerd bij het raken van G-quadruplexen, waarbij het polymerase eraf zal vallen en een nieuwe opnieuw zal binden. Met ons ontwikkelde protocol hebben we eindelijk antwoord gegeven op de vraag: hoe gedragen verschillende DNA-polymerasen zich wanneer ze een G-quadruplex tegenkomen, omdat we in realtime kunnen zien hoe de kinetiek en mechanica in de loop van de tijd veranderen? Verwijder om te beginnen een gefunctionaliseerd dekglaasje uit een stofzuiger en plaats het op een microbuisrek dat gedeeltelijk gevuld is met water om een vochtige omgeving te creëren.
Pipetteer 100 microliter van een blokkerende buffer in een buis, voeg vervolgens 25 microliter NeutrAvidin-oplossing toe en meng goed. Smeer de oplossing uit op het oppervlak van de dekglaasjes en laat het 15 minuten bij kamertemperatuur in de vochtige doos incuberen. Was vervolgens het dekglaasje met water en droog het vervolgens af met stikstofgas.
Plaats een op maat gemaakt polydimethylsiloxaanblok op de dekglaasje in een flowcelhouder. Steek polyethyleen buizen in de gaten in de flowcel. Verwarm nu een milliliter aliquots Tween-blokkeringsbuffer, 500 microliter wasbuffer en replicatiebuffer tot 40 graden Celsius gedurende 15 minuten om gassen uit de oplossingen te bevrijden.
Ontgas de oplossingen in een vacuümkamer gedurende nog eens 15 minuten bij 800 millibar onder de atmosferische druk. Breng een druppel olie aan op het objectief. Neem een geconstrueerde flowcel en plaats deze op de microscooptafel.
Breng vervolgens het doel omhoog om het dekglaasje te raken. Steek de inlaatslang in de ontgaste Tween-blokkeerbuffer en sluit de uitlaat aan op de spuitpomp. Trek vervolgens de spuit terug om de Tleen-blokkeringsbuffer door de slang in het kanaal te trekken.
Giet 200 microliter ontgaste wasbuffer in het kanaal met een snelheid van 100 microliter per minuut om de tween-blokkerende buffer weg te spoelen. Verdun nu de DNA-sjabloonoplossingen tot 0,5 picomolair in 500 microliter replicatiebuffer. Laat 150 microliter van de oplossing in het kanaal stromen met een snelheid van 10 microliter per minuut.
Verlicht het monster met behulp van een laser van 647 nanometer met ongeveer 900 milliwatt per vierkante centimeter op het monstervlak om individuele DNA-sjablonen te visualiseren. Zodra een voldoende dichtheid van vlekken zichtbaar is, stroomt u in een verse oplossing van replicatiebuffer om overtollig DNA uit te spoelen. Ga naar een nieuw gezichtsveld en maak een afbeelding van het DNA om de mate van colokalisatie tussen het gelabelde polymerase en het DNA-substraat te bepalen.
Als u klaar bent, verhoogt u het laservermogen om de resterende plekken te fotobleken. Bereid vervolgens een polymeraseoplossing voor met dithiothreitol, dNTP's en een fluorescerende sonde in de replicatiebuffer. Giet in 100 microliter van de polymeraseoplossing met een snelheid van vijf microliter per minuut in het kanaal.
Zodra het monster scherp is en de totale interne reflectiefluorescentiehoek is aangepast, stelt u het laservermogen van de 647-nanometerlaser in op ongeveer 900 milliwatt per vierkante centimeter op het monstervlak. Begin met het afbeelden van het gezichtsveld voor de gewenste tijdsduur. De G-quadruplex-sequentie blokkeerde de polymerasedeltasynthese, zoals aangegeven door de aanwezigheid van een 60-nucleotideband in de paginagel, terwijl het controlesubstraat zonder de G-quadruplex een 100-nucleotideband produceerde.
Fluorescentiemicroscopie met één molecuul bevestigde dat polymerasedelta een kortere verblijftijd had van zes plus of min twee seconden op het G-quadruplex-substraat, vergeleken met het controlesubstraat, dat een verblijftijd had van 11 plus of min drie seconden. Het aantal polymerase delta-bindingsgebeurtenissen was significant hoger op het G-quadruplex-substraat in vergelijking met de controlegroep, wat wijst op meerdere bindings- en ontbindingscycli als gevolg van de syntheseblokkade.
Overzicht
Dit onderzoek onderzoekt de dynamica van DNA-polymerasen wanneer ze G-quadruplex structuren tegenkomen, die aanzienlijke obstakels vormen tijdens DNA-replicatie. Met behulp van enkel-molecuul fluorescentiemicroscopie, visualiseert de studie het gedrag van individuele DNA-polymerase delta terwijl deze interactie aangaat met deze complexe structuren, waardoor een eerder niet-gekarakteriseerd uitwisselingspad wordt onthuld.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Onderzoeksgebied
- Dynamica van DNA-replicatie
- Enkel-molecuul methodologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Rol van DNA-polymerasen in replicatie
- Impact van G-quadruplex structuren op polymerase activiteit
- Belang van real-time visualisatie in biologische processen
Gebruikte methoden
- Fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assay
- Enkel-molecuul DNA-replicatie assay
- Aangepaste experimentele setup met flow cells en laserverlichting
Belangrijkste resultaten
- Identificeerde een nieuw uitwisselingspad voor polymerase delta bij het tegenkomen van G-quadruplexen
- Korter verblijfstijd waargenomen op G-quadruplex substraat vergeleken met controle
- Meerdere binding en ontbinding cycli gesuggereerd vanwege synthese blokkade
Conclusies
- Deze studie demonstreert het ingewikkelde gedrag van DNA-polymerasen in reactie op replicatie obstakels
- Bevindingen verbeteren het begrip van DNA-replicatie mechanismen en helpen bij toekomstig genetisch onderzoek
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence visualization of DNA polymerase dynamics at G-quadruplexes addresses a critical challenge in understanding replication fidelity and genome stability. This method enables direct observation of polymerase behavior at DNA obstacles, informing mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery. The approach supports portfolio decisions by clarifying how replication machinery responds to complex DNA structures relevant to disease and therapeutic targeting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA polymerase response to G-quadruplex roadblocks.
- Clarifies mechanistic pathways underlying replication stalling and exchange events.
- Supports functional target validation for proteins involved in genome maintenance.
- Improves predictive confidence in selecting targets affected by DNA secondary structures.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of quantitative single-molecule assays for polymerase activity.
- Enables reproducible measurement of binding kinetics and dwell times at DNA obstacles.
- Supports assay standardization for evaluating protein-DNA interactions under defined conditions.
- Prepares validated systems for downstream screening of modulators affecting polymerase dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Provides mechanistic insight into replication stress relevant to disease models.
- Aligns with translational biomarker strategies by linking polymerase behavior to genomic instability.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation of genome maintenance targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates modulating DNA replication fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule fluorescence method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymerase stalling and exchange at G-quadruplexes.
- Screening: Provides quantitative readouts of binding events and dwell times for assay readiness.
- Analytics: Delivers statistical outputs on polymerase kinetics for condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular mechanisms to disease-relevant replication stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DNA-protein interactions at single-molecule resolution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in replication biology.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying target engagement at DNA obstacles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and microfluidic assay design.
- Demands specialized instrumentation for real-time imaging and quantitative analysis.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data interpretation.
- May require adaptation for different DNA substrates or protein targets.
- Throughput and scalability are limited by imaging and analysis capacity.
