Fluorescentievisualisatie met één molecuul van DNA-polymerasedynamiek bij G-quadruplexen

Ons werk richt zich op de ontwikkeling en het gebruik van een methodologie met één molecuul om de dynamiek in complexe biologische systemen te bestuderen. In het bijzonder zijn we geïnteresseerd in het leren hoe DNA-polymerasen zich gedragen bij het tegenkomen van wegversperringen, in dit geval G-quadruplexen. We hebben een methode met één molecuul ontwikkeld op basis van fluorescentievisualisatie waarmee we het gedrag van individuele DNA-polymerasen kunnen zien bij het tegenkomen van een G-quadruplex.

Met onze test hebben we een voorheen niet-gekarakteriseerde uitwisselingsroute voor DNA-polymerasedelta geïdentificeerd bij het raken van G-quadruplexen, waarbij het polymerase eraf zal vallen en een nieuwe opnieuw zal binden. Met ons ontwikkelde protocol hebben we eindelijk antwoord gegeven op de vraag: hoe gedragen verschillende DNA-polymerasen zich wanneer ze een G-quadruplex tegenkomen, omdat we in realtime kunnen zien hoe de kinetiek en mechanica in de loop van de tijd veranderen? Verwijder om te beginnen een gefunctionaliseerd dekglaasje uit een stofzuiger en plaats het op een microbuisrek dat gedeeltelijk gevuld is met water om een vochtige omgeving te creëren.

Pipetteer 100 microliter van een blokkerende buffer in een buis, voeg vervolgens 25 microliter NeutrAvidin-oplossing toe en meng goed. Smeer de oplossing uit op het oppervlak van de dekglaasjes en laat het 15 minuten bij kamertemperatuur in de vochtige doos incuberen. Was vervolgens het dekglaasje met water en droog het vervolgens af met stikstofgas.

Plaats een op maat gemaakt polydimethylsiloxaanblok op de dekglaasje in een flowcelhouder. Steek polyethyleen buizen in de gaten in de flowcel. Verwarm nu een milliliter aliquots Tween-blokkeringsbuffer, 500 microliter wasbuffer en replicatiebuffer tot 40 graden Celsius gedurende 15 minuten om gassen uit de oplossingen te bevrijden.

Ontgas de oplossingen in een vacuümkamer gedurende nog eens 15 minuten bij 800 millibar onder de atmosferische druk. Breng een druppel olie aan op het objectief. Neem een geconstrueerde flowcel en plaats deze op de microscooptafel.

Breng vervolgens het doel omhoog om het dekglaasje te raken. Steek de inlaatslang in de ontgaste Tween-blokkeerbuffer en sluit de uitlaat aan op de spuitpomp. Trek vervolgens de spuit terug om de Tleen-blokkeringsbuffer door de slang in het kanaal te trekken.

Giet 200 microliter ontgaste wasbuffer in het kanaal met een snelheid van 100 microliter per minuut om de tween-blokkerende buffer weg te spoelen. Verdun nu de DNA-sjabloonoplossingen tot 0,5 picomolair in 500 microliter replicatiebuffer. Laat 150 microliter van de oplossing in het kanaal stromen met een snelheid van 10 microliter per minuut.

Verlicht het monster met behulp van een laser van 647 nanometer met ongeveer 900 milliwatt per vierkante centimeter op het monstervlak om individuele DNA-sjablonen te visualiseren. Zodra een voldoende dichtheid van vlekken zichtbaar is, stroomt u in een verse oplossing van replicatiebuffer om overtollig DNA uit te spoelen. Ga naar een nieuw gezichtsveld en maak een afbeelding van het DNA om de mate van colokalisatie tussen het gelabelde polymerase en het DNA-substraat te bepalen.

Als u klaar bent, verhoogt u het laservermogen om de resterende plekken te fotobleken. Bereid vervolgens een polymeraseoplossing voor met dithiothreitol, dNTP's en een fluorescerende sonde in de replicatiebuffer. Giet in 100 microliter van de polymeraseoplossing met een snelheid van vijf microliter per minuut in het kanaal.

Zodra het monster scherp is en de totale interne reflectiefluorescentiehoek is aangepast, stelt u het laservermogen van de 647-nanometerlaser in op ongeveer 900 milliwatt per vierkante centimeter op het monstervlak. Begin met het afbeelden van het gezichtsveld voor de gewenste tijdsduur. De G-quadruplex-sequentie blokkeerde de polymerasedeltasynthese, zoals aangegeven door de aanwezigheid van een 60-nucleotideband in de paginagel, terwijl het controlesubstraat zonder de G-quadruplex een 100-nucleotideband produceerde.

Fluorescentiemicroscopie met één molecuul bevestigde dat polymerasedelta een kortere verblijftijd had van zes plus of min twee seconden op het G-quadruplex-substraat, vergeleken met het controlesubstraat, dat een verblijftijd had van 11 plus of min drie seconden. Het aantal polymerase delta-bindingsgebeurtenissen was significant hoger op het G-quadruplex-substraat in vergelijking met de controlegroep, wat wijst op meerdere bindings- en ontbindingscycli als gevolg van de syntheseblokkade.