Name: In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer in vivo twee-foton calciumbeeldvorming voor netwerkdynamica in de neocortex van muizen. Deze methode maakt simultane registratie van dichte neuronale populaties met enkele-celresolutie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Olga Garaschuk erkennen voor nuttige discussies over het optimaliseren van de bulk van calcium indicatoren.

<ol><li> Bereid de fluorescerende calcium indicator oplossing. We maken gebruik van acetoxymethyl ester kleurstoffen, of AM-kleurstoffen voor kort. Dit zijn kleurstoffen die kunnen worden genomen door de cellen bij het extracellulair geïnjecteerd. Wij gebruiken meestal de Oregon-Green-BAPTA een AM-of Fluo-4 uur in een concentratie van 1 mM. AM kleurstoffen kunnen worden verkregen bij Invitrogen in 50 microgram flacons. We hebben eerst voor te bereiden een 20% oplossing van Pluronic F-127 in DMSO. We voorafgaande warm de oplossing om elke dag te gebruiken totdat het duidelijk. We ontbinding van de calcium-indicator van de 20% Pluronic F-127/DMSO gedurende 15-20 minuten tot een concentratie van 10 mM. Vervolgens hebben we verdun de oplossing tot 1 mm in een oplossing die, in mm: 150 NaCl, KCl 2,5, 10 Hepes, pH 7,4. Daarnaast wordt 100 uM sulforhodamine 101 meestal opgenomen om label astrocyten en visualiseren van de pipet tijdens de injectie. We filter de oplossing vóór injectie met een 0,49 micron centrifugaal filter (Stosiek et al., 2003;.. Garaschuk et al., 2006). </li><li> Implantaat een craniale venster over het gebied dat moet worden afgebeeld. We hebben <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">beschreven de algemene aanpak in Jupiter</a> , maar de volgende wijzigingen zijn van belang voor calcium dye injectie: Maak een kleinere craniotomie van 2 mm in diameter over de corticale gebied van belang, waarbij uiterste zorg niet aan de onderliggende dura schade. Veilig een dekglaasje op zijn plaats over de craniotomie, maar slechts gedeeltelijk betrekking hebben op de craniotomie, waardoor een kleine ruimte tussen de rand van de craniotomie en het glazen dekglaasje om ruimte voor een pipet om de cortex schuin gaan mogelijk te maken. Voorafgaand aan de injectie, maak dan een ondiepe goed met tandheelkundig cement rond de craniotomie. Het goed moet zo rostrale te breiden in de richting en zijn ondiep genoeg om het inbrengen van de micropipet voor injectie toe. </li><li> Breng de muis naar het stadium van de microscoop en immobiliseren het hoofd, zoals weergegeven in onze <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">video-on-doorbloeding beeldvorming</a> . </li><li> Trek glas micro-elektrode pipetten om een ​​tip diameter waardoor 2-4 Mega Ohm in verzet, met behulp van een pipet trekker. Laad de calcium indicator verf mengen op de glazen pipet met een micro. Met behulp van een micromanipulator voorzichtig lager de micropipet op het oppervlak van de hersenen met behulp van een 4X doelstelling, die dan fijn bevindt zich onder een 40X doelstelling. Kies een geschikte locatie voor injectie, zodat er weinig of geen bovenliggende bloedvaten naar de beeldvorming duister. Met behulp van twee-foton microscopie, de punt van de pipet wordt gevisualiseerd en geavanceerde langzaam in de cortex, tot een diepte van 200 micrometer onder de dura. Vervolgens druk injecteren de kleurstof mengsel bij 10 PSI gedurende 1 minuut met behulp van een Picospritzer. We meestal leveren twee tot vier injecties van de AM-calcium verf mengen, gescheiden in de ruimte door ongeveer 200-300 micron. Deze bulk laden benadering van iets overlappende injecties zorgt ervoor dat een gebied zo groot als 600 x 600 micron voldoende is gekleurd voor calcium beeldvorming. Begin imaging 1 uur na de injectie van de AM-kleurstof mengsel, zodat de kleurstof te verspreiden en worden opgenomen door neuronen. </li><li> Uitvoeren van in-vivo twee-foton beeldvorming met een op maat gemaakte twee-foton microscoop met behulp van een Chameleon Ti-saffier-laser (afgestemd op 800-880 nm) en Cambridge Technology galvanometer spiegels. We krijgen beelden met behulp van scanimage Software ontwikkeld in Karel Svoboda het laboratorium (Pologruto et al.., 2003). Laser Power is meestal ver onder 70 mW bij het monster. Hele veld beelden worden verkregen, hetzij met behulp van een 20X (0,95 NA) of 40X (0.8 NA) Olympus doelstellingen, bij 1.95-15.63 frames per seconde (512 x 256 pixels 256 x 64 pixels). Lijn scans worden verworven bij 500 Hz. Tijdens de beeldvorming, worden dieren gehouden onder lichte isofluraananesthesie (0.6-0.9%), en zijn ook bewaard bij 37 ° C met behulp van een Harvard Apparatuur Temperature Control Device. Zorg wordt verstaan ​​de ademfrequentie van de dieren zo dicht bij 100 ademhalingen / minuut mogelijk te maken. Dit niveau van de anesthesie te gebruiken is het laagste niveau dat het dier immobiliseert, maar nog steeds vergunningen spontane activiteit op te nemen. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

Het voordeel van deze methode meer dan elektrofysiologische opnames is dat het minder invasief en laat de opnames van de activiteit in dichte neuronale neuronale netwerken. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om uiterste zorg te nemen bij het uitvoeren van de craniotomie niet naar de dura schade. Zelfs een kleine hoeveelheid van de subdurale bloeden met een sterk obscure de beeldvorming.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 in DMSO</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugaalfilter (0,45 micron)</td><td>Reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo 2-photon imaging calcium in layer 2 / 3 van muizen

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie. De methode bestaat uit het implanteren van een schedel imaging venster, het injecteren van een fluorescente calcium indicator kleurstof die kan worden genomen door een groot aantal neuronen en tenslotte het opnemen van de activiteit van neuronen met time-lapse calcium beeldvorming met behulp van een in-vivo twee foton microscoop. Co-injectie van astrocyten-specifieke kleurstoffen kunnen een onderscheid te maken neuronen van astrocyten. De techniek kan worden uitgevoerd in muizen die fluorescerende moleculen in specifieke subpopulaties van neuronen beter inzicht in de interactie met het netwerk van verschillende groepen van cellen.

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Om de netwerkdynamiek van microcircuits in de neocortex te begrijpen, is het essentieel om de activiteit van een groot aantal neuronen gelijktijdig vast te leggen.

Om de netwerkdynamiek van microcircuits in de neocortex te begrijpen, is het essentieel om de activiteit van een groot aantal neuronen gelijktijdig in vivo vast te leggen. Calcium imaging is de enige methode waarmee de activiteit van een dichte neuronale populatie met resolutie op enkelcellniveau kan worden geregistreerd.De methode bestaat uit het implanteren van een craniaal beeldvenster, het injecteren van een fluorescente calciumkleurstof die door een groot aantal neuronen kan worden opgenomen, en tot slot het registreren van de activiteit van neuronen met time-lapse calcium-imaging. Hallo, ik ben Payman uit het laboratorium van Carlos Porter Cayo van de afdeling Neurologie aan de David Geffen School of Medicine at UCLA. In eerdere video's heeft ons laboratorium een procedure gedemonstreerd voor het uitvoeren van een craniotomie en tweefoton-imaging van de bloedstroom bij muizen.Vandaag laten we u een procedure zien voor het uitvoeren van in vivo twee-foton calciumimaging bij muizen. Laten we beginnen. Voordat we starten, moet de injectieoplossing van de kleurstof worden voorbereid.Bereid eerst de fluorescerende calciumindicatoroplossing. We maken gebruik van ethyl ester-kleurst

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.

Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

We presenteren een in vivo twee-foton imaging protocol voor beeldvorming van de hersenschors van neonatale muizen. Deze methode is geschikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, de moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en de veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.

In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Leer in vivo twee-foton calciumbeeldvorming voor netwerkdynamica in de neocortex van muizen. Deze methode maakt simultane registratie van dichte neuronale populaties met enkele-celresolutie mogelijk.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Meer video's verkennen