Optimalisatie van isolatie en zuivering van muriene glomerulaire mesangiale cellen

Een van onze onderzoeken richt zich op multipel myeloom-gerelateerde nierinsufficiëntie. Ter ondersteuning van ons onderzoek hebben we protocollen ontwikkeld en nu geoptimaliseerd voor de primaire kweek van mesangiale cellen van muizen. De benodigde apparatuur voor de procedures is gemakkelijk toegankelijk en de procedurele stappen zijn eenvoudig.

Het verwerven van doelcellen duurt slechts twee tot drie weken. Deze techniek vergemakkelijkt nieronderzoek en ondersteunt studies naar mesangiale celfunctie in ziektemodellen, therapeutische ontwikkeling of signaaltransductieonderzoek. Om te beginnen met het isoleren van muizen mesangiale cellen, of MC's, van het correct geëuthanaseerde dier, verwijdert u met een schaar en een pincet aseptisch de nieren van de muis en plaatst u ze in een petrischaaltje.

Spoel de nieren af met Earle's uitgebalanceerde zoutoplossing en gebruik vervolgens een pincet om het bindweefsel en de niercapsule voorzichtig te verwijderen. Halveer de nier verticaal met een scalpel. Voeg drie tot vier milliliter collagenase I-oplossing toe aan de petrischaal en maal het weefsel grondig met een plastic celstamper.

Pipetteer al het weefsel en de oplossing uit de petrischaal in een centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de petrischaal af met één tot twee milliliter collagenase I-oplossing om een volledige weefseloverdracht te garanderen. Plaats de buis in een shaker op 37 graden Celsius en schud gedurende 30 minuten met 120 omwentelingen per minuut.

Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid stopoplossing of kweekmedia toe aan het mengsel. Pipetteer de oplossing uit de centrifugebuis en leid deze door een celzeef van 100 micron. Vang het filtraat op in een centrifugebuis van 50 milliliter.

Laat het filtraat door een celzeef van 40 micron lopen en houd alleen de cellen op de zeef vast. Spoel de zeef herhaaldelijk af met kweekmedia één om de celverzameling te maximaliseren. Breng de verzamelde cellen van de zeef over in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter.

Centrifugeer de suspensie bij 600 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen na het centrifugeren in een celkweekschaaltje volgens de gewenste celdichtheid. Plaats de gerechten in een celbroedmachine van 37 graden Celsius met 95% lucht en 5% kooldioxide.

Voeg een tot twee milliliter PBS toe langs de binnenrand van de kweekschaal om de cellen te spoelen. Gebruik een pipet om alle PBS van de bodem van de schaal te verwijderen en voeg vervolgens 10 milliliter kweekmedia toe langs de binnenrand van de schaal. Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken, meestal binnen zeven tot 10 dagen, wast u de cellen twee keer met steriel PBS.

Voeg 0,25% trypsine-oplossing toe aan de schaal om de cellen te trypsiniseren. Plaats de schaal in een broedmachine van 37 graden Celsius. Wanneer de meeste cellen een afgeronde morfologie vertonen en loskomen van het oppervlak, beëindig dan de trypsinisatie door een gelijk volume media twee toe te voegen.

Centrifugeer de cellen bij 600 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en suspendeer ze vervolgens opnieuw in media twee. De MC's die in deze studie werden geïsoleerd, vertoonden een significant hoge expressie van alfa-SMA, fibronectine en vimentine. Immunofluorescerende kleuring van gezuiverde en gekweekte MC's, uitgevoerd na 10 dagen kweek in media twee, toonde aan dat meer dan 95% van de cellen zowel alfa-SMA als vimentine tot expressie bracht.