Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie
3 juli 2025
In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.
Ons onderzoek richt zich op de basis van neurofarmacologie. Concreet bestuderen we de werking van medicijnmoleculen. We streven ernaar de relatie tussen potentiële geneesmiddelverbindingen en de mitochondriale functie bij de ziekte van Parkinson te begrijpen.
Eerdere studies beoordelen langdurige uitdagingen op het gebied van laboratoriumcelanalyse, zelfs met richtlijnen van de fabrikant. Om dit op te lossen, hebben we een gedetailleerd stapsgewijs protocol opgesteld voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in laboratoriumcellen. Ons protocol maakt gebruik van een eenvoudige mitochondriale kleuring, fluorescentiebeeldvorming en open source software.
Dit verlaagt de kosten, verhoogt de toegankelijkheid en maakt het gemakkelijker te gebruiken dan complexe alternatieven zoals elektronenmicroscopie. Verkrijg om te beginnen culturen van SH-SY5Y-cellen gekweekt in kolven die DMEM/F12 bevatten, aangevuld met 10% FBS. Maak de cellen gedurende één minuut los met een 0,05% trypsine-oplossing.
Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende drie minuten bij 100 G alvorens te passeren. suspendeer vervolgens de SH-SY5Y-cellen in DMEM/F12-medium aangevuld met 1%FBS. Zaai de cellen vervolgens op confocale schalen met glazen bodems en bewaar ze een nacht.
Vervang voor MPP+stimulatie het kweekmedium gedurende 24 uur door vers medium met of zonder 1-methyl-4-fenylpyridinium. Voor MitoTracker-kleuring verdunt u MitoTracker stockoplossing met voorverwarmd DMEM/F12-medium om een werkconcentratie van 50 nanomolair te verkrijgen. Houd de kleuroplossing tijdens de procedure beschermd tegen licht.
Verwijder het voedingsmedium van de confocale schaaltjes. Was de cellen twee keer met verse DMEM/F12. Piket vervolgens een milliliter van de MitoTracker-werkoplossing in het schaaltje.
Incubeer 15 minuten bij 37 graden Celsius in het donker. Verwijder nu de MitoTracker-werkoplossing en was de vaat twee keer met DMEM/F12. Voeg na de laatste wasbeurt een milliliter DMEM/F12 toe aan elk gerecht.
Incubeer in de celincubator voordat u de beeldvorming uitvoert. Om de confocale microscoop voor beeldvorming vooraf in evenwicht te brengen, past u onder het acquisitiepaneel de lichtpadparameters aan door de excitatie- en emissiegolflengten in te stellen. Stel de pinhole-grootte in op 1,2 luchtige eenheden, de pixelscangrootte op 1024 bij 1024, de pixelverblijftijd op 2,4 microseconden met een gemiddelde van twee.
Gebruik nu het halogeenlicht om scherp te stellen op de cellen met behulp van een plan apochromatische 60X objectieflens met een numerieke opening van 1,4, waardoor fototoxiciteit wordt geminimaliseerd. Pas het laservermogen en de hoge spanning net onder het verzadigingsniveau aan. Stel vervolgens de zoomfactor in op drie en leg de beelden vast.
Verplaats het interessegebied om zich te concentreren op andere cellen onder de microscoop. Leg vervolgens foto's vast zonder instellingen te wijzigen. Als u de beeldkwaliteit wilt verbeteren voordat binaire transformatie en skeletvorming plaatsvindt, opent u eerst de afbeelding.
Selecteer een gebied van één cel met behulp van de ROI-tool. Klik nu achtereenvolgens op proces, filters, onscherp masker om de scherpte te verbeteren. Gebruik vervolgens het proces en verbeter het contrast om ruisversterking te verminderen.
Klik op proces, filters en de mediaanoptie om peper- en zoutruis te verwijderen. Om de afbeelding naar binair te converteren, klikt u op proces gevolgd door binair en kiest u de optie binair maken. Skelettiseer de binaire afbeelding door te klikken op proces, binair en skeletvormig.
Groepeer vervolgens alle skeletpixels door analyseren te selecteren, gevolgd door skelet en skelet analyseren 2D 3D-functie. Vereenvoudig de analyse door de MiNA-tool te gebruiken om negen beschrijvende parameters in het geskeletteerde beeld te berekenen. De fluorescentie-intensiteit van mitochondriale kleuring nam geleidelijk toe met de MitoTracker rode CMXRos-concentratie van 25 nanomolair tot 200 nanomolair.
Maar bij 200 nanomolair werd substantiële cytoplasmatische achtergrondkleuring waargenomen. Mitochondriale morfologie bleef beter behouden in DMEM/F12-medium in vergelijking met PBS één uur na kleuring, hoewel DMEM/F12 ook een hogere achtergrondfluorescentie vertoonde. Dual frame averaging verbeterde de signaal-ruisverhouding in mitochondriale beeldvorming aanzienlijk in vergelijking met de enkelvoudige scanmodus.
En het verhogen van de pixelverblijftijd van 2,4 naar 10,8 microseconden resulteerde in helderdere beelden, maar veroorzaakte fotobleking. Toenemende hoogspanning versterkte het achtergrondgeluid, terwijl een verhoogd laservermogen leidde tot fotobleken. De MiNA-tool produceerde consistente skeletvormingsuitvoer voor zowel zwakke als heldere beelden, wat wijst op robuuste segmentatie over verschillende fluorescentie-intensiteiten, waarbij het heldere beeld een 5,5 keer hogere intensiteit vertoonde dan het vage beeld.
MPP+behandeling bij 500 micromolaire verstoorde mitochondriale morfologie in SH-SY5Y-cellen in vergelijking met de onbehandelde controle, wat resulteerde in een significant verminderde mitochondriale voetafdruk.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in levende SH-SY5Y-cellen, relevant voor farmacologische studies, met name bij de ziekte van Parkinson. De methode benadrukt toegankelijkheid en lagere kosten door het gebruik van fluorescentiebeeldvorming met MitoTracker-kleuring, waarbij complexe technieken zoals elektronenmicroscopie worden vermeden.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurofarmacologie
- Mitochondriale functie
- Technieken voor celbeeldvorming
Achtergrond
- Uitdagingen bij celanalyse in het laboratorium blijven bestaan ondanks de richtlijnen van de fabrikant.
- Deze studie gaat hierop in door een stapsgewijs protocol voor de beoordeling van mitochondriale morfologie uit te lijnen.
- De focus ligt op het verlagen van kosten en het verbeteren van de toegankelijkheid voor onderzoekers.
Doel van het onderzoek
- Om een reproduceerbare methode te ontwikkelen voor het analyseren van mitochondriale morfologie in levende cellen.
- Om het begrip van de relaties tussen medicijnverbindingen en mitochondriale functie in neurodegeneratieve aandoeningen te vergemakkelijken.
- Om de effectiviteit van eenvoudige kleuringsmethoden te vergelijken met complexere beeldvormingstechnieken.
Gebruikte methoden
- Het primaire platform dat wordt gebruikt, is levende celcultuur.
- SH-SY5Y-neuroblastoomcellen worden gebruikt als het biologische model voor het onderzoeken van mitochondriale respons op farmacologische middelen.
- Beeldverwerving omvat fluorescentiemicroscopie en open-source software voor gegevensanalyse.
- Belangrijke stappen omvatten celafscheiding, MitoTracker-kleuring en beeldverwerkingstechnieken zoals skeletonisatie.
Belangrijkste resultaten
- Het ontwikkelde protocol maakt verbeterde visualisatie en analyse van mitochondriale morfologie mogelijk.
- MPP+-behandeling bleek de mitochondriale structuur in behandelde cellen significant te verstoren in vergelijking met controles.
- Fluorescentie-intensiteit en achtergrondruis zijn belangrijke factoren in beeldkwaliteit.
Conclusies
- Deze studie stelt een betrouwbare en kosteneffectieve aanpak voor het beeldvormen van mitochondriale morfologie in levende neuronen vast.
- De methode verbetert het begrip van mitochondriale dynamica in medicijnrespons, met name in neurodegeneratieve ziektemodellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial morphology in live cells is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurodegenerative disease research. This confocal microscopy protocol enables reproducible, cost-effective evaluation of mitochondrial dynamics, supporting predictive confidence in early discovery and translational workflows. The approach facilitates robust comparison of compound effects on mitochondrial structure, directly informing portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial dynamics as a functional readout for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying morphological changes under pharmacological stress.
- Provides reproducible, quantitative data to inform predictive confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream phenotypic screening of mitochondrial modulators.
- Standardizes imaging and analysis parameters to ensure assay reproducibility and comparability.
- Generates quantitative morphological outputs suitable for compound evaluation and triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology metrics with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by linking in vitro findings to preclinical endpoints.
- Facilitates biomarker development through robust morphological quantification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven decision-making.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial morphology to clarify pathway effects and biological risk.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs for compound screening workflows.
- Analytics: Provides robust, quantitative morphological parameters for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse cell models and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Needs access to fluorescence microscopes and open-source image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis parameters.
- Adaptable to various cell models with protocol optimization for each system.
- Careful calibration is necessary to minimize photobleaching and background fluorescence.
