Mitochondriaal preparaat uit microglia voor glycaananalyse

In grote lijnen richt ons onderzoek zich op het bepalen van de mechanistische rol van suikers, of glycanen, en hoe we die cellulaire en subcellulaire glycosyleringsroutes kunnen benutten bij veroudering en hersenaandoeningen. Momenteel is er een lacune in de kennis over de rol en modulatie van subcellulaire glycanen in verschillende pathofysiologieën, waaronder de acute en chronische hersenaandoeningen zoals beroerte en de ziekte van Alzheimer. Dit protocol en ons onderzoek zijn gericht op het vergroten van de kennis over de rol van glycanen in neuro-immuuninteracties, en hoe die informatie kan worden gebruikt om betere en efficiënte therapieën voor het centrale zenuwstelsel te ontwerpen.

[Verteller] Verkrijg om te beginnen BV-2 microgliacellen die zijn afgeleid van C57BL/6-muizen. Bewaar ze in DMEM medium met een laag glucosegehalte, aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren. Kweek de cellen in T175-kolven tot ze een samenvloeiing van 70 tot 80% bereiken. Zuig de media uit de kolf. Resuspendeer de celpellet in één milliliter groeimedium. Tel met trypan blue de cellen. Centrifugeer de cellen in een microcentrifugebuisje van twee milliliter bij 500 G gedurende vijf minuten. Aspiratie voorzichtig en gooi het bovenliggende weg. Voeg 800 microliter mitochondriaal isolatiereagens A toe en vortex gedurende vijf seconden op gemiddelde snelheid. Incubeer vervolgens de buis precies twee minuten op ijs. Voeg 10 microliter mitochondriaal isolatiereagens B toe en vortex gedurende vijf seconden op maximale snelheid. Incubeer vijf minuten op ijs en draai elke minuut op maximale snelheid. Voeg nu 800 microliter mitochondriaal isolatiereagens C toe en keer de buis om om te mengen. En centrifugeer bij 700 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis van twee milliliter en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 3.000 G bij vier graden Celsius. Breng het bovenstaande met het cytosolische gedeelte over in een nieuw buisje. De pellet bevat de geïsoleerde mitochondriën. Voeg 500 microliter mitochondriaal isolatiereagens C toe aan de pellet en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 12.000 G. Resuspendeer de geïsoleerde mitochondriën in 50 microliter eiwitisolatiebuffer. Laat de suspensie 20 minuten op ijs liggen. Zuig en doseer drie keer en laat 20 minuten op ijs staan, vortex voor gebruik. Als het niet volledig is opgelost, voeg dan nog eens 50 microliter buffer toe en doe het in dezelfde buis. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 G. Na het herstellen en invriezen van de supernatant, droog af met een vacuümconcentrator. Voor de detectie van vrijgekomen glycanen, suspendeer de gedroogde en gekoppelde glycanen in 50 microliter water van LCMS-kwaliteit. Pipetteer vijf microliter geresuspendeerde mitochondriale glycanen op een monsterplek op een teflon-microwell-dia. Ioniseren en detecteren van N-glycanen in negatieve ionisatiemodus met behulp van een elektrospray-oplosmiddel bestaande uit 60% acetonitril en één millimolair azijnzuur met een debiet van twee microliter per minuut en een spanning van 3,2 kilovolt. Koppel IR-MALDESI aan een HRAM-massaspectrometer die is ingesteld op een oplossend vermogen van 240.000 volledige breedte bij het halve maximum bij een massa-tot-ladingsverhouding van 200 om te analyseren tussen 502.000 massa-tot-lading verhouding in negatieve ionisatiemodus. Identificeer handmatig de N-gebonden glycanen door te zoeken naar mono-isotopische massa's. Bevestig isotopenverdelingen met behulp van massa-tot-ladingsafstand om dubbel en drievoudig geladen ionen te bepalen met een minimale ionenfluxdrempel van 1.000 ionen per seconde. Converteer de ruwe massaspectra voor massa-tot-ladingsverhoudingen naar neutrale mono-isotopische massa's. Upload vervolgens de mono-isotopische massa's naar een online voorspellingstool voor de oligosacharidestructuur om potentiële glycaansamenstellingen te bepalen. Bevestig annotaties met behulp van een experimenteel samengestelde glycodatabase. Zorg ervoor dat elke identificatie binnen de nauwkeurigheidsmarge van 2,5 delen per miljoen massameting valt, de kern en de gekoppelde glycaanstructuur bevat, en pentose, 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonzuur of uronzuurmonosacchariden uitsluit. Mitochondriale eiwitconcentraties verkregen uit zes onafhankelijke preparaten vertoonden geen significante variatie, wat een hoge reproduceerbaarheid bevestigt. Westerse bloedanalyse toonde CoxIV-expressie alleen in de mitochondriale fracties en GAPDH alleen in cytoplasmatische fracties, wat de zuiverheid van mitochondriale isolaties en de afwezigheid van niet-mitochondriale besmetting bevestigt. Verschillende gesialyseerde, gefosforyleerde en gesulfateerde N-glycaanstructuren werden gedetecteerd in mitochondriale extracten met behulp van IR-MALDESI. Hoge kwadratische waarden die een goede pasvorm testen, bevestigden de detectie van N-gebonden glycanen met één en twee chlooradducten, wat de detectie van deze glycaansamenstellingen met IR-MALDESI bevestigde.