Identificatie van Mycobacterium-soorten door middel van DNA-microarray-chipmethode

[Verteller] Dit onderzoek richt zich op moleculaire diagnostiek in de klinische microbiologie. Vergeleken met traditionele detectiemethoden is de DNA-microarray-chipmethode voor het identificeren van mycobacteriumsoorten zeer gevoelig, specifiek en snel, wat belangrijke hulp kan bieden bij de vroege diagnose van klinische patiënten. Momenteel zijn snelle identificatiemethoden voor niet-tuberculeuze mycobacteriën in veel basislaboratoria beperkt, wat een directe invloed heeft op de klinische diagnose en behandeling van de patiënt. Stel om te beginnen de temperatuur van het waterbad met constante temperatuur in op 50 graden Celsius en verwarm het voor. Om chips te bereiden, voegt u 200 microliter gedestilleerd water toe aan de bodem van de hybridisatiedoos voor genmicroarray-chips. Plaats de beugel tussen de twee positioneringskolommen in de doos. Plaats de chip voorzichtig met de voorkant naar boven op de beugel en bedek deze met de dekstrip zodat deze vier nokken naar beneden wijzen, zorg ervoor dat het uiteinde van de dekstrip is uitgelijnd met het label aan het einde van de chip. Bereid vervolgens centrifugebuisjes van 200 microliter of acht putstrips voor, afhankelijk van het aantal monsters en label ze op de juiste manier. Verwarm de hybridisatiebuffer uit de kit op 50 graden Celsius totdat deze volledig is gesmolten. Na grondig mengen, centrifugeer het snel in een microcentrifuge. Aliquot negen microliter hybridisatiebuffer in elke voorbereide buis of strip. Voeg zes microliter van het bijbehorende PCR-product toe aan elke buis, waardoor een eindvolume van 15 microliter per reactiemengsel ontstaat. Verwarm het hybridisatiereactiemengsel gedurende vijf minuten tot 95 graden Celsius om het te denatureren met behulp van een PCR-instrument of waterbad. Dompel het mengsel na de denaturatiebehandeling onmiddellijk onder in een ijswatermengsel en incubeer gedurende drie minuten. Verwijder het hybridisatiereactiemengsel uit het ijsbad en meng het door twee keer op en neer te pipetteren. Als er geen wit vlokkig neerslag achterblijft, voeg dan 13,5 microliter van het reactiemengsel toe via het laadgat van de dekslip. Dek de hybridisatiedoos snel af en verzegel deze en noteer het chipnummer, de microarray-positie en het monsternummer. Plaats nu de verzegelde hybridisatiedozen horizontaal in het waterbad met constante temperatuur dat is voorverwarmd tot 50 graden Celsius. Nadat je alle dozen erin hebt geplaatst, start je de timer op 120 minuten. Nadat de hybridisatiereactie is voltooid, haalt u de hybridisatiedozen er horizontaal uit, demonteert u ze en haalt u de spanen op. Plaats de chips onmiddellijk op het schuifrek in een container gevuld met Chip Washing Solution I die in evenwicht is gebracht met kamertemperatuur en was ze op 80 tot 100 RPM op een shaker met constante temperatuur gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Was de spanen opnieuw met Chip Washing Solution II op de shaker die is ingesteld op 80 tot 100 RPM gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Plaats nu de chips in een centrifuge en draai gedurende vijf minuten op kamertemperatuur op 100 g. Zet de scanner aan. En open vervolgens de bijbehorende software. Klik op de knop Laserbediening om het 10 minuten te laten voorverwarmen. Voer monstergerelateerde informatie in de software in. Nadat de scanner is voorverwarmd, klikt u op de knop Uitwerpen. Plaats de gedroogde spaander stevig op het kleine beugelstuk. Duw de chip voorzichtig en horizontaal in het scannercompartiment en klik op de knop Laden. Voer nu het chipnummer in de software in en klik om het detectiegebied microarray 1 tot en met 4 te selecteren. Klik op Voorbeeld selecteren om de bijbehorende voorbeelden voor elke microarray te kiezen. Klik vervolgens op Detectie starten om te beginnen met het scannen van chips. De scanresultaten worden op het scherm weergegeven en automatisch opgeslagen. Gebruik de pagina met gegevensquery's om gegevensquery's en afdrukbewerkingen uit te voeren. Nadat u alle bewerkingen hebt voltooid, schakelt u de laser uit, sluit u de software af en schakelt u ten slotte de scanner uit. De validiteit van de experimentele resultaten wordt bevestigd door kwaliteitscontrole, waarbij de positieve controle een detectieresultaat van het mycobacterium tuberculosis-complex oplevert en de negatieve controle geen mycobacterium oplevert. De interpretatie van testmonsters begint met gevallen waarin alle sondes, inclusief die met de hoogste signaalwaarde, negatief zijn, wat resulteert in een melding dat er geen mycobacterie is. In monsters waarbij alleen de sonde van het mycobacterium tuberculosis-complex een sterk signaal vertoont, wordt het resultaat als positief geïdentificeerd voor die soortgroep. Als de sonde die overeenkomt met mycobacterium avium de enige is met een sterk signaal, wordt het monster geïdentificeerd als positief voor mycobacterium avium. Als alleen de interne controlesonde positief is en alle andere negatief, wordt het resultaat als onbepaald gerapporteerd, wat wijst op de aanwezigheid van een mycobacteriumsoort die niet onder de detectiekit valt.