Magneto-reologische elastomeren met micropatroon om veranderingen in de uitlijning van cardiomyocyten te stimuleren

We onderzoeken hoe cardiomyocyten reageren op dynamische omkeerbare veranderingen in hun mechanische omgeving, waarbij we de fluctuaties in stijfheid en structuur die ze in vivo ervaren nabootsen. Sinds de introductie van de MRE hebben we verschillende belangrijke studies in de cardiologie gepubliceerd. Met behulp van deze materialen ontdekten we dat stijfheidsgedreven hypertrofie in volwassen cardiomyocyten afhankelijk is van de microtubulinetwerken.

Meer recentelijk hebben we meer informatie ontdekt over mechanisch geheugen in zowel cardiale fibroblasten als iPSC-afgeleide cardiomyocyten. Het beste aan het gebruik van magnetorheologische elastomeren is hun eenvoud. Onze protocollen zijn zo eenvoudig als het klinkt, gewoon een combinatie van kant-en-klare producten die samenwerken om iets krachtigs te creëren.

Het is een gebruiksvriendelijke aanpak die geavanceerde wetenschap voor iedereen toegankelijk maakt. Dit effende de weg voor realistischere ziektemodellen, vooral voor aandoeningen zoals hartfalen, waarbij de mechanica van het weefsel voortdurend verschuift. Het helpt onderzoekers ook bij het ontwerpen van slimmere biomaterialen die zeer afstembaar, dynamisch en omkeerbaar zijn.

Ons team heeft zich vooral gericht op hartziekten, maar onlangs hebben we het dynamisch stijvste bereik van onze MRE's uitgebreid van slechts 5 kilopascal tot wel 400 kilopascal. Die doorbraak opent de deur voor ons om ons onderzoek uit te breiden en samen te werken aan andere organen buiten het hart. Begin met het mengen van de basis en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1 om 10 gram 184 polydimethylsiloxaan, of PDMS, te bereiden.

Giet vijf gram van de 184 PDMS in een 35-millimeter petrischaal. Plaats het gerecht vervolgens in een droogapparaat en laat het ontgassen voor ongeveer vijf tot tien minuten totdat alle belletjes zijn verdwenen. Laat 184 PDMS gedeeltelijk uitharden gedurende 30 minuten in een oven op 60 graden Celsius.

Wanneer er nog vijf minuten over zijn om uit te harden, breng je een dunne laag van extra 184 PDMS aan op het oppervlak van het diffractierooster. Plaats het in een desiccator om ongeveer vijf minuten te ontgassen. Haal nu de 35-millimeter petrischaal met de gedeeltelijk uitgeharde 184 PDMS uit de oven.

Draai het diffractierooster met PDMS op de gedeeltelijk uitgeharde 184 PDMS in de schotel. Druk lichtjes op het diffractierooster totdat een kleine hoeveelheid PDMS eromheen zit. Gebruik de resterende ongeharde 184 PDMS om de schaal rondom het rooster op te vullen, zodat deze tijdens het uitharden op zijn plaats blijft.

Zet het gerecht vervolgens 1,5 uur in een oven die op 60 graden Celsius staat. Haal na het uitharden het schaaltje met het rooster uit de oven. Gebruik een scalpel om rond het diffractierooster te snijden.

Breng een kleine hoeveelheid isopropylalcohol aan om onder het diffractierooster door te dringen. Haal het rooster van de PDMS af in de richting parallel aan de patronen. Verwijder overtollige PDMS, zodat alleen het patroongedeelte intact blijft.

Knip vervolgens de PDMS-stempel op de gewenste grootte. Markeer de richting van het patroon op de MRE-schaal. Om de stempel met silaan te coaten, plaats je de gefabriceerde 184 PDMS-zegel in een zuurstofplasmareiniger met het patroon naar boven gericht.

Behandel het oppervlak 30 seconden met 45 watt zuurstofplasma. Plaats de behandelde 184 PDMS-stempels in een desiccator die in een dampkap is geplaatst. Trek nu het deksel van een microcentrifugebuis af.

Plaats het deksel van de microcentrifugebuis naast de PDMS-stempels in de desiccator. Pipetteer 20 microliter silaan op het deksel van de microcentrifugebuis. Sluit de desiccator en trek een vacuüm om dampcoating te starten.

Meet voor de MRE-voorbereiding de gewenste hoeveelheid siliconenverdunner en ECO-elastomeeronderdeel B. Meng ze één minuut op 2.500 omwentelingen per minuut in een speedmixer. Voeg ECO-elastomeerdeel A en carbonylijzerdeeltjes toe aan het mengsel en meng opnieuw met 2.500 omwentelingen per minuut gedurende één minuut. Met een transferpipet waarbij de punt afgesneden is, doe je vijf gram van het MRE-mengsel in een nieuwe 35-millimeter petrischaal.

Ontgassen in een desiccator gedurende ongeveer vijf minuten, en daarna gedeeltelijk uitharden gedurende 10 minuten in een oven op 60 graden Celsius. Als er nog vijf minuten over zijn tot uitharden, gebruik dan een transferpipet om ongehard MRE toe te voegen om alleen het patroonoppervlak van de PDMS-stempel te coaten. Plaats de gecoate stempel in een desiccator om vijf minuten te ontgassen.

Haal de gedeeltelijk uitgeharde MRE-schaal uit de oven. Met een pincet draai je de gecoate stempel met de afbeelding naar beneden op het MRE-oppervlak en druk zachtjes. Markeer de richting van het patroon op de MRE-schaal.

Plaats de samenstelling terug in de oven op 60 graden Celsius voor nog eens 25 minuten. Zodra het materiaal volledig is uitgehard, gebruik je een scalpel om de MRE aan de onderkant van de postzegel in een richting loodrecht op de patroonlijnen te kerven. Breng een kleine hoeveelheid isopropylalcohol aan op het gesneden gebied rond de stempel.

Gebruik vervolgens een pincet om de PDMS-stempel van de MRE te trekken in de richting parallel aan het patroon. Steriliseer het oppervlak van de MRE door drie keer te wassen met 70% ethanol en laat de derde wasbeurt 20 minuten staan. Was daarna het MRE-oppervlak drie keer met steriele PBS.

Bedek het oppervlak van de MRE met 10 microgram per milliliter fibronectine in PBS met magnesium en calcium gedurende een uur bij 37 graden Celsius om celadhesie aan het apparaat te bevorderen. Was tenslotte het MRE-oppervlak drie keer met PBS dat magnesium en calcium bevat, en zaad de neonatale rattencardiomyocyten met een dichtheid van 20.000 cellen per vierkante centimeter. De nauwkeurigheid van micropatroonoverdracht van de mastermal naar het MRE-substraat wordt in deze figuur aangetoond door genormaliseerde hoogteprofielen en kwantitatieve metingen van de pitch en hoogte van het feature.

De X-profielvergelijking toonde aan dat het genormaliseerde featurehoogteprofiel van de MRE nauw overeenkwam met dat van de mastermal, zij het met iets verminderde piekhoogtes en bredere featurevormen. De gemiddelde pitch van het MRE-substraat was ongeveer 10 micrometer en verschilde niet significant van de pitch van de mastermall. De gemiddelde detailhoogte op het MRE-substraat was aanzienlijk lager dan die van de mastermal, met gemiddelde waarden van respectievelijk 3,81 micrometer en 5,49 micrometer.