Efficiënte technieken voor uitgebreide bemonstering van toegankelijke weefsels bij volwassen Xenopus

Dit werk heeft tot doel een reproduceerbare methode te creëren voor het snel verzamelen van de Xenopus-hartventrikel, arteriële romp, linker leverkwab, galblaas, long, alvleesklier, milt, strottenhoofd, slokdarm, maag, darmen, teelballen, vetlichaam, eileider, gepaarde nieren, ischiasplex, huid, thymus en het hele oog in minder dan een uur. Een experimentele uitdaging is het optimaliseren van de versheid van weefsels. Om deze reden is het protocol ontworpen om in minder dan een uur te worden voltooid. Door prioriteit te geven aan de versheid van weefsels, kunnen deze weefsels worden gebruikt om biochemische analyses van hoge kwaliteit uit te voeren, zoals proteomics, terwijl het aantal gebruikte dieren wordt geminimaliseerd. In de toekomst zullen we een protocol schrijven over weefsels die moeilijker toegankelijk zijn, zoals de hersenen, spieren en botten.

[Docent] Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde kikker voor de dissectieprocedure en speld de ledematen vast. Knip met een dissectieschaar door de huid langs de middellijn en vervolgens zijdelings om twee huidflappen te maken. Pak met een tang de linea alba vast en trek deze weg van de coelomische holte. Snijd voorzichtig door de spieren naar het hoofd toe en maak twee flappen van de holtewand. Verminder de coracoïde botten om een betere toegang tot het hart te krijgen. Rek het hartzakje uit, perforeer het en trek het terug om de drie hartkamers bloot te leggen. Trim nu de orakels bij de kruising waar ze de ventrikel en arteriële stam ontmoeten. Gebruik een tang om de top van het ventrikel vast te pakken en snijd deze net onder de kruising met de arteriële romp door, zodat er een marge overblijft. Observeer de arteriële stamsplitsing, trek de stam strak en snijd de aortastammen net na de punten waar ze zich in bogen splitsen. Pak vervolgens de lip van de linker leverkwab vast en til deze voorzichtig op om de lever- en cystische kanalen bloot te leggen. Bemonster het onderste tweederde deel van de linkerlob onder deze aanhechtingen. Nadat u de galblaas hebt geïdentificeerd, pakt u deze vast en trekt u deze weg van de rechter leverkwab en verbreekt u de aanhechting. Pak vervolgens de top van de long vast en trek deze strak. Snijd de long door bij de grens waar deze overgaat in de bronchiën. Verwijder de bronchiën uit het strottenhoofd. Verschuif voor het verwijderen van de eierstokken de eierstoklobben naar hun respectievelijke zijden om de aanhechtingsplaatsen ventrale naar de nieren te visualiseren. Verwijder met een schaar de eierstokken dicht bij de nieren zonder schade aan te richten. Inspecteer vervolgens de voorkwab van de lever, ook wel de mediaankwab genoemd, en observeer de verbinding met de twaalfvingerige darm via het mesentarium. Gebruik een iridectomieschaar om het mesentaire en het hepatoduodenale ligament door te snijden. De resterende vlezige massa is de alvleesklier en de gemeenschappelijke galwegen. Verbreek de verbinding van de alvleesklier en de gemeenschappelijke galwegen van de voorste leverkwab en laat een marge over. Pak de maag vast met een getande tang en het ene uiteinde van de alvleesklier met een weefseltang. Plaag onder vergroting de alvleesklier voorzichtig weg van de maag. Identificeer vervolgens de milt en bemonster deze door de aanhechting aan het buikvlies door te snijden. Pak het strottenhoofd bij het onderste uiteinde vast en begin het uit de holte op te tillen, waarbij u alle peritoneale aanhechtingen doorsnijdt zodra u ze tegenkomt. Als het strottenhoofd verhoogd is, gebruikt u een gebogen iridectomieschaar om het slokdarmweefsel voorzichtig van het strottenhoofd te scheiden en af te knippen. Trek vervolgens het strottenhoofd naar beneden en knip het uit de mondholte terwijl u de resterende zichtbare aanhechtingen doorsnijdt. Let op de kromming van de maag, die deze onderscheidt van de slokdarm en de pylorusbeperking die het begin van de darm markeert. Snijd het spijsverteringskanaal net voor de kromming van de maag door om het van de slokdarm te scheiden. Open de mond en zoek de gedeelde opening van de buis van Eustachius op het dak. Terwijl je de mond open houdt, trek je aan de slokdarm om de aanhechting te observeren. Snijd vervolgens de slokdarm uit de mondholte net onder de opening van Eustachius. Verwijder vervolgens de slokdarm. Pak nu de maag vast en snijd hem door bij de pylorusbeperking waar hij aansluit op de twaalfvingerige darm. Trek de dikke darm strak en snijd hem zo dicht mogelijk bij de cloaca. Verwijder de darmen en snijd onderweg alle zichtbare peritoneale aanhechtingen door. Als de kikker een mannetje is, identificeer dan de teelballen en verwijder er een met een iridectomieschaar, zodat de nier intact blijft. Plaag de dikke lichamen uit elkaar en plaats ze op hun respectievelijke zijden om de peritoneale aanhechting bij de nier bloot te leggen. Pak de basis van een dik lichaam vast en snijd het uit het buikvlies, laat een marge over. Om de urineblaas te verwijderen, snijdt u zo dicht mogelijk bij de cloaca. Als de kikker een vrouwtje is of een zichtbare rudimentaire eileider heeft, pak dan het onderste uiteinde van de eileider vast en trek deze weg van de cloaca. Snijd de eileider bij de cloaca door en trek hem vervolgens uit de coelomische holte, waarbij alle peritoneale aanhechtingen worden doorgesneden. Pak met een tang de retroperitoneale gepaarde nieren vast en snijd het buikvlies aan de basis door. Til de nieren uit de holte en verbreek alle peritoneale aanhechtingen. Pak vervolgens de zenuwbundel bij de plexus ischias vast met een tang en snijd de zenuwen door waar ze de coelomische holte verlaten. Til de zenuwbundel op en snijd hem opnieuw door bij de verbinding met de wervelkolom. Verwijder nu de pinnen en draai het dier op zijn buikzijde. Speld de ledematen opnieuw vast en selecteer een achterpoot om te bemonsteren, waarbij u de voet vastzet. Snijd een amandelvormig deel van de huid weg boven het gastrocnemius en tibio fibulaire gebied. Pak de dorsale huid vast en maak een laterale incisie rond het middengedeelte van het dier. Om een continue cirkelvormige snede te creëren. Verwijder de pinnen, zet de poten in één hand vast en gebruik een tang met rattentanden om de voorste dorsale huid vast te pakken. Onthuid het dier door de rughuid krachtig over het hoofd en de armen te trekken. Om de thymus te bemonsteren, identificeert u de vetmassa die het kaakgewricht bedekt en snijdt u de achterste rand van de massa af waar deze versmelt met het roze spierweefsel. Gebruik een iridectomieschaar om de massa van het bot weg te knippen en melanofoorclusters te onthullen, indien aanwezig. Snijd vervolgens het weefsel af om eventuele spieren of kraakbeen te verwijderen. Verrep vervolgens het dier en selecteer een oog. Steek een gebogen iridectomieschaar in de baan en knip voorzichtig rond de kromming van het oog om spieraanhechtingen los te maken. Schuif ten slotte de schaar dieper in de baan en knip de oogzenuw achter het oog door. Maak het oog los van de oogkas en snijd de resterende spier weg. Door deze procedure te volgen, werden alle belangrijke organen binnen een uur na euthanasie geëxtraheerd, gespoeld en bijgesneden.