Reproduceerbare productie van SPOT als een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer

Ons onderzoek richt zich op het ontwikkelen van high-throughput, door steigers ondersteunde platforms voor robuuste, reproduceerbare, van de patiënt afgeleide orgonomische culturen om de workflow voor het screenen van geneesmiddelen te verbeteren en geavanceerde ziektemodellering te helpen.

Geautomatiseerde vloeistofbehandelaars, door steigers ondersteunde hydrogelplatforms, organ-on-a-chip-technologieën en eencellige assays zoals flowcytometrie en CYTOPs zijn enkele van de huidige beschikbare technologieën.

De huidige uitdagingen zijn onder meer het behoud van de integriteit van de hydrogel, het overwinnen van gelmeniscus voor real-time beeldvorming en het zorgen voor een uniforme celdistributie in op organoïden gebaseerde assays op lange termijn.

Ons protocol maakt consistente, door steigers ondersteunde hydrogelbelasting mogelijk, minimaliseert meniscusproblemen, ondersteunt de organoïdecultuur op lange termijn en integreert soepel met geautomatiseerde vloeistofverwerkers en een beeldvormingssysteem met hoge inhoud.

We zijn het meest enthousiast over het gebruik van onze ziektemodelleringsplatforms om ziekteprogressiemechanismen bij kanker en de ontwikkeling van obesitas te onderzoeken.

[Docent] Neem om te beginnen een PMMA-patroonsteiger voor 96 of 384 SPOT. Knip het overtollige papier rond het blauwe gebied van de steiger af en laat een witte marge van vijf millimeter rond de omtrek over. Zorg ervoor dat de resulterende plaat ongeveer 760 millimeter bij 1,300 millimeter meet. Om een 96 SPOT-steiger klaar te maken voor montage, legt u een stuk polyethyleenfilm over een stijve acrylsteun. Plaats deze met folie bedekte steun op het werkblad en leg de steiger op de polyethyleenfolie. Lijn de rand van een liniaal uit tussen de eerste twee rijen van de steiger om te voorkomen dat deze in de putten terechtkomt. Plaats het calqueerwiel aan de onderkant van de steiger en rol het onder begeleiding van de liniaal omhoog naar boven. Voor een 384 SPOT-steiger mag er niet worden geperforeerd. Leg vervolgens de steiger met de ruwe kant naar boven op een PDMS-plaat en zorg ervoor dat de rijen horizontaal lopen. Gebruik de grondlijn om te bepalen welke kant ruw is en strijk vervolgens de steiger glad op de plaat om rimpels of luchtbellen te verwijderen. Verwijder de beschermlaag van de niet-gegraveerde kant van de dubbelzijdige tape. Gesp de tape in het midden lichtjes vast en lijn de middelste twee kolommen van de tape uit met de steiger. Druk nu het midden van de tape op de steiger om de uitlijning vast te zetten. Strijk de tape vanuit het midden naar buiten glad om hem gelijkmatig te bevestigen. Til met een pincet de steiger voorzichtig op van de PDMS-plaat. Bewaar de plaat voor toekomstig gebruik. Om de steiger aan de tweede putband te bevestigen, draait u de steiger om zodat de gladde, niet-getapete kant naar boven op de werkbank ligt. Verwijder de middelste beschermlaag van de gegraveerde zijde van de tweede tape om twee centrale kolommen bloot te leggen. Gesp het midden van de tweede tape lichtjes vast en lijn deze uit met de middelste kolommen van de steiger, en druk vervolgens op het midden van de tape om deze op zijn plaats te bevestigen. Als gegraveerde tape wordt gebruikt, verwijder dan de resterende beschermlagen naast het blootgestelde midden. Strijk de tape glad, beginnend vanuit het midden en naar buiten toe. Om de steiger aan de bodemloze plaat te bevestigen, verwijdert u de beschermlaag. Lijn de steiger uit onder de bodemloze plaat met een deksel. Eenmaal uitgelijnd, drukt u het midden in op de plaat. Als u gegraveerde tape gebruikt, verwijdert u aangrenzende lagen en strijkt u de steiger vanuit het midden naar buiten op de plaat glad. Om de steiger aan de polycarbonaatfilm te bevestigen, gebruikt u een pincet om de beschermlaag voorzichtig van één kant van de polycarbonaatfilm los te maken en vervolgens langzaam de beschermlaag los te trekken zonder inkepingen in de film te veroorzaken. Herhaal het proces voor de tweede kant en leg de film vervolgens opzij op de werkbank. Pel de beschermtapelaag van de plaatbodem en druk de polycarbonaatfilm vanuit het midden naar buiten op de steiger. Druk vervolgens de polycarbonaatfilm stevig op de steiger om ervoor te zorgen dat elke put een gedefinieerde rand heeft. Snijd met een precisiemes voorzichtig overtollig materiaal van de bodem van de plaat. Plaats na volledige montage de 96 SPOT-plaat in een doorzichtige, hersluitbare plastic zak en neem deze mee naar buiten de bioveiligheidskast. Plaats een stijve acrylsteun onder de plaat en klem beide op tegenoverliggende hoeken. Bewaar de plaat in een schone, droge ruimte tot verder gebruik. Er werd geen medialek of -uitwisseling waargenomen wanneer afwisselende putjes in de 384 SPOT-plaat werden gevuld met fluoresceïne en PBS gedurende een testperiode van 30 dagen, wat de werkzaamheid van de PMMA-barrière bij het handhaven van well-to-well isolatie bevestigt. Pancreastumororganoïden die GFP tot expressie brengen, gezaaid in 96 SPOT-platen, bleven levensvatbaar en breidden zich geleidelijk uit van dag nul tot dag 12 van de kweek. Op dag 12 vertoonden SPOT-gekweekte organoïden een sterke expressie van cytokeratine 19 en Zonula Occludens-1, samen met de aanwezigheid van interne lumenstructuren. Suboptimale en optimale resultaten voor het zaaien van weefsel in 384 SPOT-platen waren visueel te onderscheiden door randdefinitie en uniformiteit van de celverdeling. Met behulp van de geautomatiseerde vloeistofverwerker werd een consistent uniforme zaaiing bereikt over de gehele 96 SPOT- en 384 SPOT-platen.