Name: Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer BRET-gebaseerde biosensoren voor het meten van G-eiwitactivatie in levende HEK293-cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van GPCR-signalering mogelijk voor farmacologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs.</a> Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Advances+in+structures%2C+mechanisms%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">protein pathways.</a> Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).</li>
<li>Hepler, J. R., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">G proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).</li>
<li>Van Unen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+FRET+sensors+for+robust+measurement+of+G%CE%B1i1%2C+G%CE%B1i2+and+G%CE%B1i3+activation+kinetics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells.</a> PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2411 (2001).</li>
<li>Galés, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+activation-promoted+structural+rearrangements+in+preassembled+receptor-G+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).</li>
<li>Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+constitutive+G+protein-coupled+receptor+activity+with+BRET-based+G+protein+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors.</a> Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).</li>
<li>Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+GPCR+functional+assays+based+on+resonance+energy+transfer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).</li>
<li>Scott-Dennis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+membrane-based+Gi-CASE+biosensor+assay+for+profiling+compounds+at+cannabinoid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors.</a> Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).</li>
<li>Violin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+signaling+and+desensitization+elucidated+by+quantitative+modeling+of+real-time+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics.</a> J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).</li>
<li>Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+isoproterenol+modulation+of+beta-adrenergic+receptor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics.</a> Life Sci. 38, 309-315 (1985).</li>
<li>Thomas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+receptor+binding+analyses+of+cannabinoid+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists.</a> J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).</li>
<li>Schihada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+GPR35+have+distinct+extracellular+N-termini+that+allosterically+modify+receptor-transducer+coupling+and+mediate+intracellular+pathway+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias.</a> J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6664">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68463">10.3791/68463</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68463">BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

<table><tbody><tr><td>Advanced 96-well culture plate, white with transparent flat bottom, with lid, Greiner bio-one</td><td>Dutscher</td><td>655983</td><td></td></tr><tr><td>BrightMax ClearLine White Film</td><td>Dutscher</td><td>760245</td><td></td></tr><tr><td>ClarioSTAR LVF</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DPBS Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM) GlutaMAX</td><td>Sigma</td><td>D0822</td><td>Verwarm in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Venus</td><td>Addgene</td><td>168122</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ Gift van Gunnar Schulte</td></tr><tr><td>Galphas(short isoform)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-Venus</td><td>Addgene</td><td>168124</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ Gift van Gunnar Schulte</td></tr><tr><td>HEK-293T stably expressing CB1R (HEK CB1)</td><td></td><td></td><td>Vriendelijk geschenk van M. Guzman (Complutense University, Madrid, Spanje)</td></tr><tr><td>HEK-293T wild-type (HEK wt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>Gelooid in H20 en bewaard bij &ndash; 20 &deg;C</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>116668019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium GlutaMAX Supplement</td><td>Fischer</td><td>11564506</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 Flag beta-2-adrenergic-receptor tag FLAG C-ter</td><td></td><td></td><td>Vriendelijk geschenk van D. Perrais (IINS, Bordeaux)</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-(empty)-TAG</td><td>Addgene</td><td>138209</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma</td><td>RNBL7086</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WIN-55,212-2</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10009023</td><td>Gelooid in DMSO en bewaard bij &ndash; 20 &deg;C</td></tr></tbody></table>

op bret gebaseerde g-eiwitbiosensoren voor het meten van g-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of transmembrane receptors, playing a crucial role in cellular signaling by transducing ...

bret-based-g-protein-biosensors-for-measuring-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Eenvoudige methoden om de selectieve activering van G-eiwitten door G-eiwit-gekoppelde receptoren te detecteren, blijven een grote uitdaging in celsignalering. Hiervoor zijn Fӧrster resonantie-energieoverdracht (FRET) biosensoren ontwikkeld door een GPCR paarsgewijs vast te maken aan G-eiwitpeptiden om conformationele veranderingen te onderzoeken bij gecontroleerde concentraties in levende cellen.

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.

Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via de S1P-receptoren (S1PR's) subfamilie. Hier wordt een pijplijn beschreven om de structuren en functie van S1PR's uit te leggen.

Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Leer BRET-gebaseerde biosensoren voor het meten van G-eiwitactivatie in levende HEK293-cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van GPCR-signalering mogelijk voor farmacologisch onderzoek.

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

Meer video's verkennen