Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

Nu ons protocol, presenteren we multimodale beeldvorming met behulp van confocale Raman-microspectroscopie en tomografische fasemicroscopie voor snelle en onbevooroordeelde morfochemische fenotypering van menselijke borstkankercellen in hun oorspronkelijke fysiologische omgeving. De combinatie van Raman-microspectroscopie en tomografiefasemicroscopie maakt labelvrije beeldvorming onder fysiologische omstandigheden mogelijk, waardoor biochemische en morfologische informatie over cellen wordt verkregen en de beperking van conventionele perturbatieve methoden, zoals fluorescentie-etikettering of chemische fixatie, wordt aangepakt. Onze resultaten tonen een groot potentieel aan van het implementeren van een multimodale benadering bij het leveren van morfochemische fenotypering van borstkankercellen. Bovendien vormden de veelzijdigheid, reproduceerbaarheid en niet-invasieve eigenschappen ervan een veelbelovend hulpmiddel voor een breed scala aan biomedische toepassingen, van fundamentele celbiologische studies tot diagnostiek.

We streven ernaar een atlas van optische biomarkers te maken voor niet-invasieve embryonale kwaliteitscontrole, het detecteren van cellulaire veroudering en het screenen van geneesmiddelen in organoïdemodellen om regeneratieve geneeskunde en ziekteonderzoek te bevorderen.

[Docent] Plaats om te beginnen het MDA-MB-231 menselijke borstkankercelmonster in de incubator op het podium. Voeg water toe voor het doel van de onderdompeling in water. Schakel de geautomatiseerde waterdompelgoot in om water naar de objectieflens te voeren. Controleer regelmatig het waterpeil om verdamping te voorkomen en zorg voor consistente beeldvormingsomstandigheden tijdens de metingen. Schakel nu de pomplaser in en pas de output aan om een laservermogen van 75 milliwatt op het monstervlak te bereiken. Open de Micro-Manager microscoopbesturingssoftware. Selecteer in de configuratie-instellingen BF en klik op live aan de linkerkant van het softwarevenster. Kies de gewenste afzonderlijke cel en klik vervolgens op stop om de helderveldvisualisatie te beëindigen. Open de CCD-camerabesturingssoftware. Stel in de experimentinstelling de belichtingstijd in op 1,5 seconde. Klik op de werkbalk van het experiment uitvoeren en schakel de laserstraal in. Pas vervolgens de Z-positie aan om het aantal signalen in het vingerafdrukgebied te maximaliseren van 600 tot 1.800 inverse centimeter en schakel vervolgens de laser uit. Klik op stop op de werkbalk van het experiment en sluit de software af. Start het data-acquisitieproces met behulp van het MATLAB-script, dat automatisch Raman-kanalen in multidimensionale metingen beheert en de gegevens opslaat. Stel het gezichtsveld in op 50 bij 50 micrometer in het vierkant met een resolutie van 40 bij 40 pixels, waarbij elke pixel 1,25 bij 1,25 micrometer in het vierkant beslaat. Stel de belichtingstijd voor elk Raman-spectrum in op 1,5 seconde en voer het MATLAB-script uit. Voor de nabewerking van Raman-hyperspectrale kaarten start u de webgebaseerde tool RamApp. Importeer de hyperspectrale gegevens door op nieuw te klikken in het tabblad mijn analyses en upload het .mat-bestand met de ruimtelijke en spectrale gegevensvariabelen, samen met de variabele X-as. Als u het spectrum wilt afkappen, kiest u in het menu Bijsnijden en roteren de optie Spectraal bijsnijden. Definieer de inferieure en superieure grenzen van het Raman-verschuivingsgebied als respectievelijk 600 en 1.800 inverse centimeter. Om te corrigeren voor kosmische straling, ga naar ruisonderdrukking, klik op despike, selecteer Z-score als methode en stel de drempel in op acht. Controleer de opties gebruik eerst verschil en corrigeer spikes en klik vervolgens op uitvoeren om de correctie toe te passen. Als u ruis uit de kaarten wilt verwijderen, klikt u op vloeiende kaart, kiest u het mediaanfilter, stelt u de grootte van het vierkant in op drie pixels en klikt u vervolgens op Uitvoeren. Om het spectrum van elke pixel vloeiender te maken, kiest u het Savistky-Golay-filter. Stel de lengte van het filtervenster in op zeven en de polynomiale volgorde op twee en klik vervolgens op uitvoeren. Als u het gemiddelde achtergrondsignaal wilt aftrekken, opent u Optisch substraat verwijderen en klikt u op Substraat identificeren. Stel k-means in als de methode met twee clusters. Klik vervolgens op Geavanceerde opties. Kies morfologische reiniging om kleine klodders van de voorgrond te verwijderen en klik vervolgens op uitvoeren. Om het gemiddelde achtergrondsignaal te verwijderen, klikt u op substraat verwijderen, kiest u vervolgens het globale gemiddelde of gemiddelde van de centrale methode van 95% van de waarden en klikt u op uitvoeren. Om te corrigeren voor basislijnfluorescentie, opent u het basislijnpaneel, klikt u op de juiste basislijn, selecteert u adaptieve vloeiendheid PLS, stelt u lambda in op 5 miljoen en klikt u op uitvoeren. Voor de normalisatie van elke hyperspectrale kaart van Raman, gaat u naar diversen, selecteert u normaliseren, kiest u de Frobenius-methode en klikt u op uitvoeren. Als u een afbeelding met valse kleuren wilt genereren die de subcellulaire distributie laat zien, klikt u in het afbeeldingenpaneel op het geopende menusymbool onder intensiteitsafbeelding en klikt u vervolgens op afbeelding bewerken. Selecteer in het bewerkingsvenster een enkele band en definieer het spectrale bereik. Kies nu dubbele kleur op de kleurenkaart en definieer vervolgens de kleur, intensiteitsdrempel en dekking voordat u op bevestigen klikt. Voor het downloaden van een enkel puntspectrum kiest u een interessante pixel en klikt u vervolgens in het deelvenster Spectrale legenda op Spectrum downloaden. Als u ten slotte voorgrond- en substraatspectra wilt exporteren, navigeert u naar de spectrale legenda en klikt u vervolgens op spectrum downloaden voor zowel voorgrond- als substraatsecties. Plaats een druppel gedestilleerd water op de objectieflens van de microscoop. Plaats het monster op de translatietafel van de microscoop en pas vervolgens de positie van het monster aan om het uit te lijnen met de objectieflens. Zet de microscoop aan en start de beeldvormingssoftware. Klik op het microscooppictogram op de werkbalk. Klik na de initialisatie op configuratie, selecteer live cel in het taakvenster en PBS als het medium. Ga vervolgens naar het kalibratietabblad in het configuratiescherm van de beeldvormingssoftware. Stel de axiale posities van de objectief- en condensorlenzen in door respectievelijk focus en oppervlak te selecteren. Klik nu op de scanmodus om de lenzen handmatig aan te passen en ervoor te zorgen dat de verlichtingspatronen gecentreerd en bijna statisch zijn. Kies de normale modus en pas vervolgens de vertaalfase aan om de cel in het gezichtsveld te brengen en focus op het voorbeeld. Pas de vertaalfase aan om een gebied zonder cellen te lokaliseren. Kies Kalibreren om meerdere 2D-hologrammen vast te leggen met verschillende verlichtingshoeken. Pas de vertaalfase aan om de cel te centreren, navigeer vervolgens naar het acquisitietabblad en selecteer 3D-snapshot om het tomogram van de cel vast te leggen. Als u de holografische tomogrammen wilt visualiseren, selecteert u de gegevens in het gegevensnavigatiepaneel, klikt u met de rechtermuisknop en klikt u op openen. Klik in het paneel voor gegevensbeheer op RI-tomogram. Selecteer in het deelvenster Volumevisualisatie de optie RI en teken vier rechthoekige kleurvakken in het RI-canvas. Stel de minimum- en maximumwaarden van het RI-bereik in voor elk kleurvak en koppel vervolgens een dekking en kleur aan elk vak. Klik op opslaan om de gedefinieerde RI-bereiken en kleurvakken op te slaan. Gebruik de analyse-interface om kwantitatieve descriptoren van celmorfologie te verkrijgen. Selecteer handmatig onder het segmentatiepaneel, stel vervolgens 1,3450 in als de RI-drempel en klik op toepassen. Klik op opslaan om de berekende morfologische indexen op te slaan. Raman spectrale kartering onthulde de ruimtelijke verdeling van cytoplasma, kern, fenylalanine en lipiden binnen individuele MDA-MB-231-cellen. Duidelijke Raman-spectrale pieken die overeenkomen met cytoplasma, kern, fenylalanine en lipiden werden bevestigd in het vingerafdrukgebied tussen 600 en 1.800 inverse centimeter. Brekingsindex heatmaps van afzonderlijke cellen onthulden de interne distributie van subcellulaire componenten in het axiale XY-vlak, het sagittale YZ-vlak en het coronale XZ-vlak. Een 3D-tomografische reconstructie identificeerde gebieden met een volumetrische brekingsindex die overeenkomen met interne substructuren. Kwantitatieve morfologische metingen van een enkele MDA-MB-231-cel toonden verschillende descriptoren van celmorfologie, met een totaal volume van 4024.189 kubieke micrometer en een oppervlakte van 2383.707 vierkante micrometer, met een gemiddelde brekingsindex van 1.356.