Name: Op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Ontdek CRISPRshuttle klonen voor efficiënte DNA-fragmentoverdracht tussen vectoren zonder PCR-amplificatie. Deze methode bespaart tijd en middelen bij grootschalig genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar Powder</td><td>Chembase</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Automated Digital Gel Image Analysis System</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>LongGene</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>Platinum SuperFi II DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Incubator</td><td>Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 Chemically Competent Cell</td><td>TransGen</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

op crispr gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Gene targeting-methodologieën kunnen worden gebruikt om transgene muizen te genereren met knockout-, knock-in- en getaggede allelen. Hier beschrijven we een verbeterde methode van recombineren in E. coli, die we 'subklonen plus invoegen' noemen, en die kan worden gebruikt om snel aangepaste gene targeting-vectoren te genereren.

Subkloning Plus Insertion (SPI) - A Novel recombineering Methode voor de snelle bouw van gene targeting vectoren

Met behulp van DNA assembly kunnen meerdere CRISPR vectoren parallel worden geconstrueerd in een enkele klonen reactie, waardoor de bouw van grote aantallen vectoren CRISPR een eenvoudige taak. Tomaat harige wortels zijn een uitstekend model systeem om CRISPR vectoren te valideren en het genereren van mutant materialen.

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Dit protocol beschrijft de stappen voor het kloneren van meerdere single-guide RNA's in een RNA-concatemervector, die bijzonder geschikt is voor het creëren van multi-gen-knockouts met behulp van CRISPR / Cas9-technologie. De opkomst van dubbele knockouts in darmorganoïden wordt getoond als een mogelijke toepassing van deze methode.

Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

Hier is een eenvoudige, efficiënte en kosteneffectieve methode van sgRNA klonen geschetst.

CRISPR gids RNA klonen voor zoogdieren systemen

Dit manuscript wordt een geclusterde regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) CRISPR-Cas9-gebaseerde methode voor eenvoudige en snelle onderzoek van de rol van meerdere kandidaat-genen in Acute myeloïde leukemie (AML) celproliferatie in beschreven parallel. Deze techniek is schaalbaar en kan worden toegepast in andere kanker cel beeldlijnen.

Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Dit protocol beschrijft een hoge doorvoer plasmide transfectie van zoogdiercellen in een 384-goed plaat met behulp van akoestische druppel ejectie technologie. De tijdrovende, foutgevoelige DNA-afgifte en multiplexing, maar ook de transfectie-reagens afgifte, zijn softwaregestuurd en worden uitgevoerd door een nanodispenser apparaat. De cellen worden vervolgens in deze voorgevulde putten gesest.

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten werden geïntegreerd in het schema van Booleaanse poorten in Saccharomyces cerevisiae. De nieuwe kleine logische circuits toonden goede prestaties en verdiepten het begrip van zowel op dCas9/dCas12a gebaseerde transcriptiefactoren als de eigenschappen van anti-CRISPR-eiwitten.

Gene digitale circuits op basis van CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten

We presenteren een protocol voor CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass), een methode voor high-throughput constructie van UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek in Drosophila met behulp van openbaar beschikbare cDNA/ORF-bronnen. CRISPRmass kan worden toegepast op het bewerken van verschillende plasmidebibliotheken.

Op CRISPR gebaseerde modulaire assemblage voor high-throughput constructie van een UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Ontdek CRISPRshuttle klonen voor efficiënte DNA-fragmentoverdracht tussen vectoren zonder PCR-amplificatie. Deze methode bespaart tijd en middelen bij grootschalig genetisch onderzoek.

Op CRISPR gebaseerde shuttle-klonen: een kloonmethode met hoge doorvoer

Meer video's verkennen