Genereren van hele bacteriële genomen uit klinische monsters met behulp van een workflow voor doelverrijking

Genomen kunnen informatie verschaffen over de afkomst, overdracht en capaciteiten van een ziekteverwekker. Voor niet-kweekbare bacteriën kan deze informatie alleen worden verkregen door doelverrijking. Het sequencen van bacteriële pathogenen rechtstreeks uit klinische monsters is een uitdaging vanwege het overweldigende menselijke DNA, de diverse microbiota en de extreem lage bacteriebelasting.

In veel gevallen is kweken geen optie, vanwege de bemonsteringsmethode en kieskeurige bacteriën. Terwijl we deze technologie toepasten op seksueel overdraagbare bacteriën, ontdekten we een nieuwe Chlamydia trachomatis LGV-afstamming genaamd ompA-genotype L4, en bevestigde we de wereldwijde uitbreiding van de dominante LGV-afstamming, wat belangrijke inzichten oplevert voor moleculaire diagnostische en epidemiologische surveillance. Dit voortgangsverrijkingsprotocol maakt volledig genoomherstel mogelijk uit positief gediagnosticeerde klinische soa-monsters.

We ontdekten dat deze techniek beter presteert dan metagenomische diepe sequencing, DNA-depletie van de gastheer en adaptieve sequencing van nanoporiën. We onderzoeken de circulerende stammen van deze ziekteverwekkers in Europa en in Argentinië. Dit heeft het potentieel om informatie te verstrekken over overdracht en antimicrobieel beheer.

Meet om te beginnen de DNA-concentratie van de DNA-extracten van klinische monsters met behulp van een gevoelige en nauwkeurige op fluorescentie gebaseerde methode. Verdun elk DNA-monster met nucleasevrij water tot 10 tot 200 nanogram in een eindvolume van 17 microliter in elke PCR-buisstrip. Voeg 3 microliter fragmentatiemastermix toe aan elk putje met de 17 microliter verdund DNA.

Pipetteer 20 keer op en neer om goed te mengen. Sluit vervolgens de strip van de PCR-buis. Draai de strip gedurende 10 seconden op hoge snelheid en draai kort om de inhoud te verzamelen.

Plaats vervolgens de PCR-buisstrip in de thermische cycler en start het voorgeprogrammeerde protocol voor fragmentatie en incubatie. Bereid vervolgens de eindreparatie en dA-tailing mastermix voor zoals aangegeven in de tabel. Draai en draai de buis zoals eerder getoond en houd hem op ijs.

Piket vervolgens 20 microliter van de eindreparatie en dA-tailing mastermix in elk putje met 50 microliter DNA-fragmenten. Sluit de strip en vortex acht seconden op hoge snelheid af. Nadat u de strip kort hebt rondgedraaid, plaatst u deze terug in de thermische cycler.

Zodra het thermische cycler-programma is voltooid, plaatst u de strip van de PCR-buisjes op ijs. Voeg vervolgens 25 microliter ligatiemastermix op kamertemperatuur, die 30 tot 45 minuten van tevoren is bereid, toe aan elk putje met de DNA-fragmenten. Voeg 5 microliter adapter oligo-mix voor NBC-gelabelde bibliotheken toe aan elke put.

Plaats de strip van het PCR-buisje onmiddellijk terug in de thermische cycler en ga verder met het programma. Om met de DNA-zuivering te beginnen, haalt u de magnetische kralen op bij 4 graden Celsius en laat u ze voor gebruik op kamertemperatuur komen. Voeg vervolgens 80 microliter toe aan elk monsterputje.

Plaats de strip van de PCR-buis op de magnetische standaard en was elk goed twee keer met 200 microliter 70% ethanol. Wacht een minuut tijdens elke wasbeurt en verwijder voorzichtig de ethanol zonder de magnetische kralen te verstoren. Na het mengen en incuberen van de kralen met 35 microliter nucleasevrij water gedurende vijf minuten, zuigt u het geklaarde supernatans voorzichtig op uit elk putje en brengt u het over in een corresponderend putje in een nieuwe PCR-buisstrip.

Plaats de nieuwe PCR-buisstrip op ijs en gooi de magnetische kralen weg. Neem het voorbereide pre-recapture PCR-reactiemengsel en voeg er 11 microliter van toe aan elk monsterputje met de gezuiverde DNA-bibliotheek. Voeg 5 microliter van de geselecteerde index prime repair toe aan elke reactie en sluit de strip van de PCR-buisjes af.

Start het thermische cyclerprogramma voor PCR-amplificatie zoals gespecificeerd in de tabel om de pre-capture PCR uit te voeren. Voeg de PCR-buisstrip pas toe als de thermische cycler 98 graden Celsius heeft bereikt. Nadat u de pre-capture PCR hebt voltooid, voert u nog een opschoning op basis van kralen uit om de bibliotheek te zuiveren.

Incubeer het PCR-product met magnetische kralen. Plaats vervolgens de PCR-stripbuis op een magnetisch scheidingsapparaat en wacht 5 tot 10 minuten totdat de oplossing helder wordt. Terwijl de strip op de magnetische standaard blijft zitten, verwijdert u voorzichtig het doorzichtige bovenstaande uit elk putje en gooit u het weg.

Elueer vervolgens het DNA in 15 microliter nucleasevrij water en meet de DNA-concentratie van de gezuiverde DNA-bibliotheek. Programmeer voor monsterhybridisatie de thermische cycler volgens het hier gespecificeerde protocol. Start het programma en pauzeer de run direct.

Verdun 500 tot 1.000 nanogram van de voorbereide DNA-bibliotheken tot een eindvolume van 12 microliter met behulp van nucleasevrij water. Na het vortexen en ronddraaien van de oligonucleotideblokkermix, voegt u 5 microliter toe aan elke monsterbuis. Sluit de strip van de PCR-buis af en plaats deze in de thermische cycler.

Pauzeer de thermische cycler wanneer deze stap drie van het protocol bereikt. Voeg 13 microliter van de voorbereide sondehybridisatiemix op kamertemperatuur toe aan elk monster terwijl u de strip in de thermische cycler houdt. Pipetteer langzaam 8 tot 10 keer op en neer om te mengen.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn en plaats de strip terug in de thermische cycler. Controleer vervolgens of alle buisjes goed zijn afgesloten. Om de gehybridiseerde bibliotheek vast te leggen, brengt u het hele volume van elke buis over naar de overeenkomstige buizen met 200 microliter voorgewassen streptavidinekorrels.

Verzamel de streptavidinekorrels voordat u ze wast met wasbuffer op kamertemperatuur. Zodra de strip van de PCR-buis uit de magnetische scheider is verwijderd, voegt u 200 microliter wasbuffer op hoge temperatuur toe, voorverwarmd tot 70 graden Celsius, en suspendeert u de kralen opnieuw door op en neer te pipetteren. Sluit de buisstrip af, draai met hoge snelheid en draai snel zoals eerder gedemonstreerd.

Plaats de afgedichte buisstrip in het thermische cyclerblok bij 70 graden Celsius en incubeer gedurende 5 minuten. Breng de PCR-buisstrip van de thermische cycler bij kamertemperatuur terug naar de magnetische scheider. Wacht een minuut totdat de oplossing duidelijk wordt.

Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant en gooi deze weg. Voeg vervolgens 25 microliter nucleasevrij water toe aan elk buisje met de kralen. Programmeer de thermische cycler zoals gespecificeerd in de hier getoonde tabel.

Voeg 25 microliter van het bereide PCR-reactiemengsel na afvang toe aan elke monsterbuis. Meng de reactie totdat de suspensie uniform is en sluit de strip van de PCR-buisjes goed af zonder deze naar beneden te draaien. Plaats de verzegelde PCR-buisstrip in de thermische cycler.

Nadat u het PCR-product in een vers buisje hebt overgebracht, voegt u 50 microliter kralensuspensie toe aan elk monsterbuisje en voert u de DNA-opschoning uit zoals eerder getoond. Meet de DNA-concentratie van het uiteindelijke gezuiverde bibliotheek-DNA met behulp van een op fluorescentie gebaseerde kwantificeringsmethode. Doelverrijking resulteerde in significant hogere percentages on-target reads, en dus volledige genomen in vergelijking met directe sequencing van alle geteste pathogenen, waaronder Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum en Mycoplasma Genitalium.

Het succes van genoomsequencing werd voornamelijk waargenomen in monsters met qPCR-cyclusdrempelwaarden onder de 30 voor alle vier de pathogenen. Met een duidelijke omgekeerde correlatie tussen CT-waarden en het percentage on-target metingen voor Chlamydia trachomatis. Met behulp van een hybridisatietemperatuur van 62,5 graden Celsius in vergelijking met de vorige 65 graden Celsius, verbeterde de genoomdekking voor mycoplasma genitalium zonder de prestaties voor de andere doelpathogenen te verminderen.

Fylogenetische analyse van Chlamydia trachomatis-genomen uit Argentinië toonde veel monsters aan die zich groepeerden binnen de L2b-clade en onthulde een nieuwe afstamming voorgesteld als ompA-genotype L4, gescheiden van alle eerdere LGV-genomen door ongeveer 600 single nucleotide polymorfismen.