Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

We streven ernaar om real-time, labelvrije beeldvormingsmethoden op te zetten bij het monitoren van biofysische veranderingen in levende organoïden tijdens de ontwikkeling en in reactie op medicijnen. Dit protocol faciliteert een gestroomlijnde schaal van beeldvorming en niet-invasieve medicijntesten in levende organoïden, ondersteund door AI-gestuurde mutatie en kwantitatieve textuurselectie voor biomedisch onderzoek. We zijn van plan om labelvrije 3D-beeldvorming en een jaaranalyse verder te integreren voor niet-invasieve organoïdenstudies met hoge resolutie in ziektemodellering en nauwkeurige geneeskunde.

Zuig om te beginnen het gebruikte medium op uit elk putje van een plaat met 48 putjes die de extracellulaire matrix bevat. Voeg 200 microliter celhersteloplossing toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Vang met een pipet voorzichtig de organoïde suspensie op en breng deze over in een microcentrifugebuisje.

Centrifugeer de buis gedurende drie minuten op 150 g en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant. Om de pellet mechanisch te dissociëren, resuspendeert u deze opnieuw in 200 microliter kweekmedium en pipeteert u de suspensie 20 tot 30 keer op en neer met behulp van een P200-pipet voordat u deze gedurende drie minuten centrifugeert. Voeg na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant medium en verse extracellulaire matrix, of ECM, in een verhouding van één op vier toe aan de pellet en pipetteer voorzichtig om grondig te mengen.

Doseer 15 microliter van het mengsel per koepel in elk putje van een plaat met 48 putjes. Plaats de plaat een uur ondersteboven in een incubator van 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide om polymerisatie van de ECM mogelijk te maken. Voeg na polymerisatie 200 microliter vers kweekmedium toe aan elk putje en vul de lege buitenste putjes met PBS.

Om het monster voor te bereiden op beeldvorming, doseert u 15 microliter organoïde ECM-koepel op een beeldvormingsschaal met dekglaasbodem nummer 1,5 en incubeert u deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Zet de plaat een uur ondersteboven in een 37 graden Celsius, 5% kooldioxide incubator. Voeg vervolgens voorzichtig voldoende kweekmedium toe om de organoïden volledig onder te dompelen.

Vijf dagen na de passage wast u het monster twee tot drie keer met PBS onmiddellijk voor de beeldvorming. Schakel vervolgens voor beeldvorming de omgevingscontroller in. De kamercontroller stelt automatisch de temperatuur in op 37 graden Celsius en kooldioxide op 5%Druk op de deurknop om de deur te openen.

Voeg water toe om een dunne laag in de kamerput te vormen. Plaats de beeldvormingsschotel in de vathouder, plaats deze in de beeldkamer en zet deze vast met een pin om beweging te voorkomen. Sluit de deur om interferentie van extern licht te voorkomen.

Start nu de TomoStudio X-software en log in. Klik op Start om het hoofdvenster te openen en klik vervolgens op Project toevoegen in de linkerbovenhoek en wijs het experiment toe. Controleer of het juiste mediumtype is geselecteerd voor het juiste gebruik van de brekingsindex.

Klik op de gewenste put in het paneel en klik vervolgens bovenaan op Maken om de put als monster te registreren. Klik vervolgens op ROI-instelling in de rechterbovenhoek om het interessegebied in het gerecht te definiëren. Eenmaal ingesteld, klikt u op Experiment uitvoeren in de rechterbenedenhoek om het venster Afbeeldingsacquisitie te openen.

Klik in de hoek op Laadschip om een helder veldbeeld weer te geven. Pas de Z-positie aan met de Z- en Z-knoppen om het beeld scherp te stellen. Pas op het tabblad Single Imaging de ROI-grootte aan.

Vang organoïden in een gezichtsveld van 160 micrometer bij 160 micrometer en verkrijg stapels tot 140 micrometer diep. Navigeer naar het tabblad Time-lapse-beeldvorming om langetermijnbeeldvorming in te stellen en de gewenste duur en intervaltijd in te stellen. Klik op het pictogram Scannen om de huidige ROI-locatie vast te leggen.

Klik op de BF-knop om de intensiteit en belichtingswaarden voor helderveldbeelden aan te passen. Verplaats het vak ROI in het deelvenster Voorbeeld om de ROI te selecteren. Zodra de gewenste ROI is geselecteerd, klikt u onderaan op Punt toevoegen, de lijst met beeldpunten wordt gemaakt.

Klik nu op Verkrijgen om te beginnen met beeldvorming en om de onbewerkte afbeeldingsgegevens te verkrijgen. Start de HTX Processing Server door op het pictogram Bureaublad te klikken. Sleep onbewerkte afbeeldingsbestanden naar de HTX-verwerkingsserver.

Klik op Verwerken om een TCF-bestand te genereren op basis van het onbewerkte afbeeldingsbestand. Start TomoAnalysis Viewer door op het pictogram Bureaublad te klikken. Laad de verwerkte TCF-bestanden door ze naar het kijkvenster te slepen en neer te zetten.

Dubbelklik op een bestandsminiatuur om het ROI-tomogram te openen. Bekijk de 2D-weergave door door de X-, Y- en Z-vlakken te navigeren met behulp van zoom-, pan- en scrollbedieningselementen. Klik op het pictogram voor de MIP-renderingweergave aan de linkerkant om over te schakelen naar de 3D-rendermodus.

Navigeer door de 3D-weergave door de afbeelding te roteren, zoomen en pannen. Voor de op machine learning gebaseerde beeldsegmentatie exporteert u het TCF-afbeeldingsbestand naar HDF5-indeling om ervoor te zorgen dat de gegevens in een multidimensionaal formaat zijn dat compatibel is met ilastik. Open ilastik en navigeer naar Nieuw project.

Selecteer Pixelclassificatie onder de sectie Segmentatieworkflow en sla het project op in een aangewezen map. Als u het HGF5-bestand wilt laden, navigeert u naar het tabblad Invoergegevens, klikt u op Nieuw bestand toevoegen, selecteert u de juiste H5-gegevensset en controleert u de juiste toewijzingen van afbeeldingskanalen. Navigeer nu naar het tabblad Functieselectie om functies zoals kleur, intensiteit, rand en textuur te kiezen om de segmentatie te optimaliseren.

Label op het tabblad Training de organoïde en niet-organoïde regio's met penseelstreken in verschillende kleuren. Klik op Live Update om een voorbeeld van de segmentatieresultaten te bekijken en indien nodig aanpassingen aan te brengen. Als u klaar bent, gaat u naar het tabblad Export van voorspellingen.

Selecteer Eenvoudige segmentatie als bron om gelabelde voorspellingen te exporteren en klik op Alles exporteren. Stel de exportindeling in op H5 of TIFF op basis van de analysevereisten. Open voor de kwantitatieve analyse het aanvullende coderingsbestand 2.

Wijs de juiste mappaden aan voor het maskerbestand en het bijbehorende TCF-bestand in het script. Voer de code uit om kwantitatieve analyse te starten. De code berekent het organoïdevolume, de eiwitdichtheid en het totale eiwitgehalte voor elke dataset.

Deze figuur illustreert de driedimensionale brekingsindexreconstructies met hoge resolutie die worden gebruikt om de algehele morfologie van organoïden in de dunne darm te visualiseren. De gerenderde reconstructies onthullen duidelijke structurele verschillen tussen met vehiculum behandelde en met cisplatine behandelde organoïden over alle drie de optische sectiediepten. Met cisplatine behandelde organoïden vertoonden een significant hoger volume, een lagere eiwitdichtheid en een hoger totaal eiwitgehalte, vergeleken met met vehiculum behandelde organoïden 10 minuten na de behandeling, wat wijst op vroege structurele zwelling en veranderde eiwitsamenstelling.

Time-lapse-beeldvorming gedurende 24 uur toonde aan dat met vehiculum behandelde organoïden structurele integriteit behielden, terwijl met cisplatine behandelde organoïden progressieve structurele degradatie ondervonden, waaronder collaps van de crypte en verhoogde celdissociatie, wat wijst op tijdsafhankelijke cytotoxische schade. Kwantitatieve tracking bevestigde dat met vehiculum behandelde organoïden in de loop van de tijd in volume en eiwitgehalte toenamen, terwijl met cisplatine behandelde organoïden een tijdsafhankelijke afname van beide parameters vertoonden, wat aangeeft dat cisplatine de groei onderdrukte en cellulaire afbraak induceerde. De eiwitdichtheid bleef stabiel in met vehiculum behandelde organoïden, maar nam geleidelijk af in met cisplatine behandelde organoïden gedurende de periode van 24 uur, wat wijst op een afbraak van de cellulaire structuur en een grotere extracellulaire ruimte als gevolg van exfoliatie.