Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Een virale infectie kan aanzienlijke veranderingen in de cellulaire infrastructuur veroorzaken. Om deze veranderingen in drie dimensies te visualiseren, gebruiken we STEM-tomografie voor beeldvorming van virusgeïnfecteerde cellen. STEM-tomografie is tijdrovend en arbeidsintensief.

Dit maakt optimale monstervoorbereiding essentieel voor biologische monsters, zoals virusgeïnfecteerde sets. Conventionele STEM-tomografie is beperkt tot monsterziekten van ongeveer 200 nanometer. Ons protocol maakt 3D-beeldvorming van dikkere delen mogelijk.

Dit maakt een meer uitgebreide visualisatie mogelijk van virusgeïnfecteerde cellen en de ultrastructurele veranderingen. Veel oncolytische virussen zijn oorspronkelijk al klinische proeven, daarom werken onderzoekers en ontwikkelaars wereldwijd samen, en de wetenschap verlegt de grenzen van kankerbehandeling en geavanceerde methoden zoals elektronenmicroscopie en STEM-tomografie leveren nieuwe inzichten. We blijven virologische vragen beantwoorden door gebruik te maken van STEM-tomografie en combineren deze met nieuwe voorbereidingsprotocollen en andere microscopietechnieken.

Begin met het vullen van de LN-box met vloeibare stikstof ter voorbereiding op het hanteren en overbrengen van de bevroren saffierschijven van de hogedrukvries- of HPF-houder naar de opslagcapsules. Houd een dewar gevuld met vloeibare stikstof in de buurt om de LN-box bij te vullen tijdens het invriesproces. Houd een geïsoleerde pincet klaar.

Bereid de monstercontainers voor die de saffierschijven na HPF zullen bevatten. Zorg ervoor dat ze een deksel en meerdere gaten hebben voor vloeibare stikstof om in te gieten, en kleine gewichten zodat ze niet kunnen drijven. Plaats de labelcontainer in de LN-doos om vooraf af te koelen voordat je het gebruikt.

Plaats de monsters vervolgens in de broedmachine. Inspecteer de saffierschijven onder een omgekeerde lichtmicroscoop om voldoende cellen en goede celkwaliteit te garanderen voordat je begint met hoogdrukvriezen. Om HPF uit te voeren, neem je één saffierschijf uit de kweekschaal en dep je die snel op filterpapier om overtollig materiaal te verwijderen.

Plaats de schijf in de HPF-houder met de koolstofgecoate zijde naar boven gericht, zodat het nummer twee leesbaar is. Doop een gouden afstandhouder in hexadecane en plaats die voorzichtig op de saffierschijf. Plaats een tweede saffierschijf bovenop de afstandhouder met de koolstofbedekte zijde naar beneden gericht om een sandwichconfiguratie te vormen waarbij de cellen naar elkaar wijzen, zodat er geen lucht vastzit.

Sluit de HPF-houder voorzichtig en snel om de spanning op het monster te verminderen. Steek de HPF-houder in de hogedrukvriezer. Vergrendel het volgens de instructies van de fabrikant en start het vriesproces.

Vervolgens zet je de HPF-houder over in de LN-box. Vervolgens zet je de tip met de saffierschijven in de pre-koel LN-box. Haal de schijven voorzichtig uit de houder.

Plaats de gesloten cryoflesjes gevuld met een vrije substitutieoplossing in een vrij substitutieapparaat dat voorgekoeld is tot min 90 graden Celsius. Wacht tot de oplossing dezelfde temperatuur bereikt. Pre-koel pincet, een scalpel en tang of grote pincet door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof voor gebruik bij het overbrengen van de saffierschijfjes.

Overbreng de hogedrukbevroren monsters naar het vrije substitutieapparaat. Scheid de saffierschijfjes één voor één, terwijl je ze in vloeibare stikstof houdt. En breng elke schijf snel afzonderlijk over in een cryo-buis met gratis substitutieoplossing, zodat de schijf volledig is ondergedompeld.

Na het sluiten van het cryo-flesje, plaats het onmiddellijk terug in het vrije substitutieapparaat. Zodra alle monsters zijn geplaatst, start je het substitutieproces. Zodra de monsters 20 graden Celsius bereiken.

Ga door met het wassen van de monsters drie keer gedurende 30 minuten, elk met 100% aceton. Om de monsters vooraf te inbedden, incubeer je ze in een derde epoxyhars en twee derde aceton gedurende een uur. Na het incuberen van de monsters met tweederde epoxyhars en een derde aceton gedurende een uur, wissel je de oplossing met 100% epoxyhars en breng je het een nacht uit met het buisdeksel open zodat de resterende aceton de volgende dag kan verdampen, en breng je de saffierschijfjes over in nieuwe gelabelde reactiebuizen gevuld met vers bereide epoxyhars.

Plaats de schijven horizontaal, ondersteund door de wand van de buis, zodat de zijde met cellen naar boven kijkt. Plaats vervolgens de reactiebuizen met open deksels in een oven die op 60 graden Celsius staat en laat de hars minstens 48 uur polymeriseren. Nadat de epoxyhars is gepolymeriseerd, dompel je de punt van een gesloten reactiebuis ongeveer 10 seconden onder in vloeibare stikstof.

Sla de reactiebuis op een tafel om het harsblok los te maken. De saffierschijf zal gemakkelijk loskomen van de koolstoflaag, die aan de ingebedde cellen blijft zitten. Selecteer het interessegebied in de ingebedde steekproef en beperk de steekproefgrootte tot het interessegebied.

Met behulp van een ultramicrotoon en een diamantmes verzamel je secties van ongeveer één micrometer dikte op een Poly-L-lysine behandeld glotus-geladen parallel staafraster voor STEM-beeldvorming en STEM-tomografie. Behandel secties met colloïdaal goud als fiduciale markers en breng een koolstofcoating aan. Na het snijden en inspecteren van ultradunne secties zijn de monsters klaar voor beeldvorming.

Op basis van de onderzoeksvraag voeg je ofwel de bright field detector, de dark field detector, of beide in. Activeer de scanmodus en maak een testbeeld van het monster. Kies een vergroting hoger dan 800.000 keer, wat groter is dan de uiteindelijk gewenste vergroting.

Dicht bij het interessegebied stel je de focus aan en corrigeer je astigmatisme, terwijl je directe bundelblootstelling op de kritieke monstergebieden vermijdt. Stel de excentrische hoogte zo in dat het interessegebied, of ROI, gecentreerd blijft over het hele kantelbereik. Kies een feature dicht bij het rendement (ROI), breng het naar het midden, focus, corrigeer astigmatisme en kantel het podium stapsgewijs tot min 72 graden.

Om het gezichtsveld te kiezen, navigeer je terug naar de ROI, breng het scherp en maak je een overzichtsafbeelding. Stel de uiteindelijke vergroting in die gewenst is voor de vergelijking van de kantelserie. Stel automatische kantelserie-opname van beelden in, variërend van min 72 graden tot plus 72 graden, en beeld elke 1,5 graden.

Start de geautomatiseerde tilt-serie acquisitie. Representatieve virtuele sneden uit het STEM-thermogram illustreerden hoe de oriëntatie van virionen de zichtbaarheid van de karakteristieke kogelvorm in tweedimensionale beelden beïnvloedt. Alleen virionen die parallel aan het kijkvlak waren uitgelijnd, verschenen met de volledig goed gedefinieerde kogelmorfologie, terwijl andere cirkelvormig of langgerekte leken, afhankelijk van hun hellingshoek.

Om de oriëntatiebeperkingen van 2D-beeldvorming te overwinnen, werd STEM-tomografie gebruikt om grote clusters van ontstellende recombinante vesiculaire stomatitisvirusvirions vast te leggen, waardoor de virionvorm in drie dimensies zonder directionele bias kon worden beoordeeld. De zijaanzicht van het thermogram bevestigde het volumetrische voordeel van STEM-tomografie, waarbij veel complete virionen in één enkele 600-nanometer dikke sectie werden vastgelegd, in tegenstelling tot de beperkte bemonstering die mogelijk is met een 200-nanometer TEM-sectie.