Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

We richten ons op speciale biologie om de moleculaire mechanismen van eierstokkanker beter te begrijpen, in de hoop nieuwe therapeutische doelen en biomarkers te vinden om de overleving van patiënten te voorspellen. Een van de huidige IMC-uitdagingen omvat de dissectie van eiwitten met lagere abundantie, het werk van antistofvalidatie en titrering, evenals de complexe en tijdrovende pixelclassificatie tijdens de analyse. Begin met het verwijderen van overtollig vocht uit de voorbereide FFPE-glaasjes.

Haal de vochtigheidsregelplaat uit de oven en plaats de schuifhouder in de bakplaat. Vervolgens vortex RNA-ISH Amplifier 3 grondig en voeg je genoeg reagens toe om elke weefselsectie op de glaasjes volledig te bedekken. Sluit de bakplaat en plaats hem 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40 graden Celsius.

Tijdens de incubatie bereid je het metaal oligonucleotidemengsel voor door elke oligo te verdunnen in een verhouding van één op 15. Voer het metaal oligo-mengsel grondig in vortex en laat het op kamertemperatuur staan tot verder gebruik. Haal nu de vochtigheidsregelplaat uit de oven.

Haal de schuifhouder uit de vorm en zet de bakplaat terug in de oven. Plaats de glaasjes vervolgens in een doorzichtige glaashouder die vooraf is gewassen met nucleasevrij water. Was de dia's twee minuten in een wasbuffer onder lichte roering.

Na het verwijderen van overtollig vocht uit de slides haal je de vochtigheidsregelplaat uit de oven en plaats je de slidehouder in de bakplaat. Voeg de eerder bereide gemengde metaaloligonucleotiden toe om elk weefselgedeelte volledig te bedekken. Sluit nu de bakplaat helemaal en plaats hem 45 minuten in de hybridisatieoven op 40 graden Celsius.

Haal de vochtigheidsregelplaat uit de hybridisatieoven, haal de schuifhouder eruit en zet de lege bakplaat terug in de oven. Om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, voeg je een voldoende volume blokkeringsbuffer toe om elk weefselgedeelte op de preparaat volledig te bedekken, en breng je de glaasjes 30 minuten op kamertemperatuur. Terwijl de glaasjes incuberen, bereid je de antilichaammix voor door de antilichamen te verdunnen met behulp van de antistofverdunningsbuffer.

Zodra de incubatie is voltooid, gooi je de buffer van de weefselglaasjes weg en geef je genoeg van het eerder voorbereide antistofmengsel om de weefselsecties volledig te bedekken. Plaats de preparaten vervolgens in een luchtvochtige kamer en breng ze een nacht uit op vier graden Celsius. Om een verse Iridium-intercalatoroplossing te bereiden, maak je een verdunning van één op 2.000 uit een 500-micromolaire voorraadoplossing met RNase-vrije TBS.

Plaats de glaasjes in een doorzichtige glaashouder die voorgewassen is met nucleasevrij water, en was de glaasjes vijf minuten in een TBS-T buffer met lichte roering. Voeg vervolgens de preparaten toe om de preparaten te kleuren en voeg je de voorbereide Iridium-werkoplossing toe en laat je vijf minuten op kamertemperatuur incuberen. Daarna plaats je de glaasjes in een doorzichtige glaashouder die vooraf is gewassen met nucleasevrij water.

Was de dia's twee keer in TBS-T buffer met lichte beweging gedurende vijf minuten. Doop de glaasjes vervolgens snel in dubbel gedestilleerd water om zoutkristallisatie door TBS op het weefsel te voorkomen. Droog de preparaten 10 minuten onder een chemische kap en bewaar ze op vier graden Celsius tot het beeld is genomen.

Laad de voorbereide glaasglaas in de ablatiekamer van het beeldvormingsmassacytometriesysteem. Maak een panoramafoto van de dia om het interessegebied te identificeren. Met behulp van de beeldverwervingssoftware markeer je de gewenste interessegebieden op het panoramabeeld.

Pas de verwervingstemplate toe in de beeldverwervingssoftware. En pas het laservermogen aan op basis van het type monster. Begin nu met het laserablatieproces.

Meet de hoeveelheid van elke isotoop met behulp van de detector, die de gegevens omzet in digitale vorm voor analyse. De activatiestatus van CD8 T-cellen werd beoordeeld met co-detectie van granzyme B op zowel mRNA- als eiwitniveau, samen met interferon-gamma positiviteit. Een kankergeassocieerde fibroblast bleek MFAP5-eiwit en POSTN mRNA tot expressie te brengen, beide markers voor kankergeassocieerde fibroblastagressiviteit.

Een CD4 T-cel bleek IL17A en IL6 mRNA co-expressief, wat consistent is met de identiteit van de TH17-cel. Er werden geobserveerd dat CD4 T-cellen IL13 mRNA tot expressie brachten. Keratine-positieve CD47-positieve tumorcellen werden aangetoond nabij een CD8 T-cel.

Een geactiveerde CD8 T-cel bleek CD25-eiwit tot expressie te brengen. Vergelijkbare mRNA-kleuring van THBS2 en CD47 werd waargenomen tussen metaalconjugeerde en fluorescerend gelabelde protocollen.